黃曉丹，呂輝珍，靳思思，郭潤(rùn)民，吳 文△

(1南方醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州 510515;2廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東省人民醫(yī)院東病區(qū)內(nèi)分泌科，廣東 廣州 510080;3中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，廣東 廣州 510080)

雷奈酸鍶(strontium ranelat，Sr)是一種新型的抗骨質(zhì)疏松藥物，具有抑制破骨細(xì)胞骨吸收和促進(jìn)成骨細(xì)胞骨形成的雙重作用[1]，鍶鹽代表了在骨質(zhì)疏松癥治療史上一個(gè)新的發(fā)展方向。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是一種多潛能成體干細(xì)胞，具有向成骨細(xì)胞分化的能力。在BMSCs向成骨細(xì)胞分化中，受到多種信號(hào)通路調(diào)控，其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)、Wnt、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和刺猬蛋白(Hedgehog)信號(hào)通路發(fā)揮了重要作用。TGF-β1也在骨形成和骨吸收中的平衡方面起重要的作用，可促進(jìn)BMSCs向成骨分化，抑制其向破骨細(xì)胞分化，它在骨重建過(guò)程中的作用逐漸成為人們研究的熱點(diǎn)[2-3]。Smads蛋白直接參與 TGF-β超家族成員的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，它作為TGF-β下游的信號(hào)蛋白分子，將TGF-β信號(hào)從細(xì)胞外轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)，是TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的始動(dòng)因子[4-5]。Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx2)又稱為核心結(jié)合因子 α1亞基(core-binding factor，alpha 1 subunit，Cbfα1)，是一種多功能轉(zhuǎn)錄因子蛋白，在成骨細(xì)胞的分化和骨形成方面起重要的作用，TGF-β等多種因子可作為Runx2的上游調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)Runx2 的活性[6-7]。

我們前期研究已經(jīng)證實(shí)Sr可通過(guò)上調(diào)TGF-β1和Runx2表達(dá)，促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化[8]。因此，本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步闡明Sr是否通過(guò)TGF-β1/Smad信號(hào)通路誘導(dǎo)BMSCs向成骨分化。

材料和方法

1 主要材料

Sr干混懸劑由法國(guó)Servier公司惠贈(zèng);4周齡SD大鼠購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自Gibco;青霉素、β-甘油磷酸鈉、地塞米松和抗壞血酸購(gòu)自Sigma;堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;細(xì)胞茜素紅(alizarin red s)鈣染色試劑盒購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司;兔抗大鼠Smad2、p-Smad2和Runx2單克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling;GAPDH購(gòu)自上?？党缮镉邢薰?SB431542購(gòu)自Bioworld;Smad2小干擾RNA(Smad2-siRNA)由廣州市銳博生物科技有限公司合成;脂質(zhì)體 2000(Lipofectamine 2000，Lipo2000)Opti-MEM 購(gòu)自Invitrogen。

2 主要方法

2.1 大鼠BMSCs的獲取 取4周齡SD大鼠頸推脫臼處死，75%乙醇浸泡5～10 min，無(wú)菌操作下取雙側(cè)股骨和脛骨，剪去干垢端，用無(wú)菌注射器吸取含有10%胎牛血清、1×105U/L青霉素G和100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔得到骨髓細(xì)胞懸液，并移至15 mL離心管;1000 r/min離心5 min，制成單細(xì)胞懸液，以(1～3)×105cells/cm2接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng);24 h后半量換液，以后每2～3 d換液1次;倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，至細(xì)胞融合至80%時(shí)進(jìn)行傳代，此后每隔3～4 d傳代1次。

2.2 BMSCs的成骨誘導(dǎo) 選取第3～5代BMSCs，將細(xì)胞種植于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后加入成骨誘導(dǎo)液(含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素、10-8mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L抗壞血酸的DMEM/F12培養(yǎng)基)培養(yǎng)。

2.3 ALP活性的檢測(cè) 選取第3～5代BMSCs接種于24孔板，各實(shí)驗(yàn)組給予不同處理因素后，在第7 d采用酶標(biāo)法檢測(cè)ALP活性。檢測(cè)時(shí)將細(xì)胞收集后以0.2%Triton X-100裂解液裂解，裂解后用PBS洗2遍，12000 r/min離心10 min，取上清液按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，于酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定結(jié)果。

2.4 茜素紅鈣化結(jié)節(jié)染色 選取第3代BMSCs，接種于24 mm×24 mm 6孔板中，6孔板底部預(yù)先置入消毒過(guò)的載玻片。各組給予相應(yīng)處理因素后，于第21 d對(duì)樣本進(jìn)行固定、染色及澄清處理。以上各步驟嚴(yán)格按照細(xì)胞茜素紅鈣染色試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。倒置顯微鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)染色并拍照，每組取4個(gè)樣本，每樣本隨機(jī)取1個(gè)視野(×100)，比較各組間的差異。

2.5 Western blotting法檢測(cè) p-Smad2、Smad2 和Runx2蛋白的表達(dá)水平 選取第3代細(xì)胞，接種于60 mm培養(yǎng)皿中，收集細(xì)胞時(shí)，先用預(yù)冷的PBS洗2遍，加入細(xì)胞裂解液，4℃裂解20～30 min，在冰上用預(yù)冷的細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下移至1.5 mL EP管中，12000 r/min離心10 min，取上清液移至新的EP管中。應(yīng)用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。經(jīng)SDS-PAGE垂直凝膠電泳分離后，9 V 30 min轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后分別加入 p-Smad2抗體 (1∶1500)、Runx2抗體(1∶500)及 GAPDH(1∶5000)，4 ℃搖床孵育過(guò)夜，TBST 5 min洗3次后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶2500)孵育1 h，之后 TBST 5 min 洗3 次，最后用發(fā)光試劑ECL顯色，曝光，曝光后用TBST洗膜2～3 h，加入 Smad2(1∶1000)抗體。用 Smartview 軟件分析目標(biāo)條帶灰度值，與內(nèi)參照GAPDH條帶灰度值校正后進(jìn)行半定量分析。

2.6 RNA干擾技術(shù) 設(shè)計(jì)3條Smad2特異性siRNA及1條陰性siRNA。操作時(shí)帶手套，使用無(wú)RNA酶的槍頭、EP管和試劑。瞬時(shí)離心后，用滅菌ddH2O將siRNA凍干粉配成20 μmol/L儲(chǔ)存液，分裝保存，避免反復(fù)凍融。轉(zhuǎn)染前1 d，接種適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞至培養(yǎng)板或皿中，用不含雙抗培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)60%～70%。轉(zhuǎn)染時(shí)先制備 siRNA-Lipo2000混合液:先用不含血清培養(yǎng)基Opti-MEM分別稀釋siRNA儲(chǔ)存液、Lipo2000，輕輕混勻，室溫5 min將2種混合液混勻，室溫孵育20 min，將siRNA-Lipo2000混合液加入不含雙抗的細(xì)胞培養(yǎng)基中，混勻。6 h后棄去混合液，更換新鮮不含雙抗的培養(yǎng)基，培養(yǎng)2～3 d后進(jìn)行加藥處理。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Sr上調(diào)p-Smad2表達(dá)

圖1A 顯示用 0.1、1、3、5 和 10 mmol/L Sr分別處理BMSCs 1 h，均可明顯上調(diào)p-Smad2表達(dá)。當(dāng)Sr為1 mmol/L時(shí)，p-Smad2的表達(dá)達(dá)到峰值，Sr為3、5和10 mmol/L時(shí)逐漸減少，但仍高于對(duì)照組(P＜0.01)。圖1B顯示，應(yīng)用1 mmol/L Sr分別處理BMSCs 15、30、60、120 和 360 min，Sr作用 60 min 時(shí) p-Smad2的表達(dá)達(dá)到峰值，120 min和360 min時(shí)呈逐漸減小趨勢(shì)，但仍高于對(duì)照組(P＜0.01)。

2 Sr上調(diào)Runx2表達(dá)

圖2顯示，應(yīng)用1 mmol/L Sr分別處理BMSCs 1、3、5和7 d，Sr作用第5 d時(shí)，Runx2表達(dá)達(dá)到峰值，第7 d較第5 d表達(dá)有所減少，但仍高于對(duì)照組(P＜0.01)。

3 TGF-β1阻斷劑拮抗Sr對(duì)p-Smad2表達(dá)的上調(diào)作用

圖 3顯示，1 mmol/L Sr處理 BMSCs 1 h，p-Smad2表達(dá)較對(duì)照組明顯增加(P＜0.01);TGF-β1特異性阻斷劑SB431542預(yù)處理BMSCs 1 h，可明顯地阻斷Sr對(duì)BMSCs p-Smad2表達(dá)的上調(diào)作用，與Sr處理組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

Figure1.Strontium ranelate(Sr)enhanced the expression of p-Smad2 in BMSCs.A:BMSCs were treated with different concentrations of Sr;B:BMSCs were treated with Sr at 1 mmol/L for different time.Mean±SD.n=3.##P ＜0.01 vs control(0 mmol/L or 0 min).圖1 Sr對(duì)BMSCs p-Smad2表達(dá)的影響

4 Smad2 siRNA有效鏈的篩選

圖4顯示，與Sr組相比較，Smad2-siRNA的3條片段均能降低Smad2蛋白的表達(dá)(P＜0.01)，其中Smad2-siRNA003的作用最為明顯(P＜0.01)。

5 Smad2-siRNA對(duì)Sr誘導(dǎo)p-Smad2表達(dá)上調(diào)的影響

圖 5顯示，1 mmol/L Sr處理 BMSCs 1 h，p-Smad2表達(dá)較對(duì)照組明顯增加(P＜0.01)，Smad2 siRNA轉(zhuǎn)染BMSCs后，再予以1 mmol/L Sr處理細(xì)胞，Sr誘導(dǎo)p-Smad2的表達(dá)增加較單純Sr組明顯減少(P ＜0.01)。

Figure2.Effect of Sr on the expression of Runx2 in BMSCs of rats.BMSCs were treated with 1 mmol/L Sr for the different time.Mean ± SD.n=3.#P ＜ 0.05，##P ＜0.01 vs 0 d.圖2 Sr對(duì)BMSCs Runx2表達(dá)的影響

Figure3.Inhibitor of TGF-β1(SB431542)inhibited Sr-induced over-expression of p-Smad2 in BMSCs of rats.Sr:BMSCs were treated with Sr(1 mmol/L)for 1 h;Sr+SB431542:BMSCs were pretreated with 1 mmol/L SB431542 for 1 h，followed by treatment with Sr(1 mmol/L)for 1 h.Mean±SD.n=3.##P ＜0.01 vs control;＊＊P ＜0.01 vs Sr.圖3 TGF-β1阻斷劑SB431542拮抗Sr對(duì)BMSCs p-Smad2表達(dá)的上調(diào)作用

Figure4.Screening of the effective Smad2-siRNA.BMSCs were transfected with Smad2-siRNAs，followed by treatment with Sr.Mean ±SD.n=3.##P ＜0.01 vs Sr.圖4 Smad2-siRNA有效鏈的篩選

Figure5.Smad2-siRNA inhibited overexpression of p-Smad2 induced by Sr in BMSCs of rats.Sr:BMSCs were treated with Sr(1 mmol/L)for 1 h;Sr+Smad2-siRNA or Sr+non-target siRNA:BMSCs were transfected with Smad2-siRNA or non-target siRNA，followed by treatment with Sr.Mean± SD.n=3.##P ＜0.01 vs control;＊＊P ＜ 0.01 vs Sr.圖5 Smad2-siRNA抑制Sr誘導(dǎo)的BMSCs p-Smad2表達(dá)

6 Smad2-siRNA對(duì) Sr誘導(dǎo) Runx2表達(dá)上調(diào)的影響

圖6顯示，1 mmol/L Sr處理 BMSCs 5 d，Runx2表達(dá)較對(duì)照組明顯增加(P＜0.01)，Smad2-siRNA轉(zhuǎn)染BMSCs后，再予1 mmol/L Sr處理細(xì)胞，Sr誘導(dǎo)的Runx2表達(dá)增多較Sr組明顯減少(P＜0.01)，提示Smad2通路介導(dǎo)Sr對(duì)BMSCs Runx2表達(dá)的上調(diào)作用。

Figure6.Effect of Smad2-siRNA on the increased Runx2 expression induced by Sr in BMSCs of rats.Sr:BMSCs were treated with Sr(1 mmol/L)for 1 h;Sr+Smad-2siRNA or Sr+non-target siRNA:rBMSCs were transfected with Smad2-siRNA or non-target siRNA，followed by treatment with Sr.Mean ± SD.n=3.##P ＜0.01 vs control;＊＊P ＜0.01 vs Sr.圖6 Smad2-siRNA抑制Sr誘導(dǎo)的BMSCs Runx2表達(dá)

7 Smad2 siRNA對(duì)Sr誘導(dǎo)的ALP活性增加的影響

圖7顯示，與對(duì)照組比較，1 mmol/L Sr處理BMSCs 7 d明顯增加ALP活性(P＜0.05);Smad2-siRNA轉(zhuǎn)染BMSCs后，使Sr對(duì)ALP活性的促進(jìn)作用受到明顯抑制，與 Sr處理組相比，差異顯著(P＜0.05)。

8 Smad2 siRNA對(duì)Sr誘導(dǎo)鈣結(jié)節(jié)數(shù)量增多的影響

圖8顯示，1 mmol/L Sr處理BMSCs 21 d可顯著增加鈣結(jié)節(jié)的數(shù)量;Smad2-siRNA轉(zhuǎn)染BMSCs后，使Sr對(duì)鈣結(jié)節(jié)形成的促進(jìn)作用受到明顯抑制。

Figure7.Effect of Smad2 siRNA on the increased activity of ALP induced by Sr in BMSCs of rats.Sr:BMSCs were treated with 1 mmol/L Sr for 7 d;Sr+Smad2-siRNA or Sr+non-target siRNA:rBMSCs were transfected with Smad2-siRNA or non-target siRNA，followed by treatment with 1 mmol/L Sr for 7 d.Mean±SD.n=3.##P ＜0.01 vs control;＊＊P ＜0.01 vs Sr.圖7 Smad2-siRNA對(duì)Sr誘導(dǎo)的BMSCs ALP活性增加的影響

Figure8.Effect of Smad-2siRNA on Sr-induced mineralization in BMSCs of rats(alizarin red S staining，×100).Sr:BMSCs were treated with 1 mmol/L Sr for 21 d;Sr+Smad2-siRNA or Sr+non-target siRNA:BMSCs were transfected with Smad2-siRNA or non-target siRNA，followed by treatment with 1 mmol/L Sr for 21 d.圖8 Smad2-siRNA對(duì)Sr誘導(dǎo)的BMSCs鈣結(jié)節(jié)增多的影響

討 論

BMSCs的定向成骨分化受到多種信號(hào)通路的調(diào)控[9]，已經(jīng)明確的包括 TGF-β 通路、Notch 通路[10]、PI-3K 通路、Wnt通路、Hedgehog[11]通路和 MAPK 通路，其中包括 p38 MAPK 通路[12]、ERK 通路和 JNK通路[13]。TGF-β超家族包括多個(gè)亞家族，它們是一類結(jié)構(gòu)相似、功能不同的肽類物質(zhì)，包括TGF-βs、激活素(activins)、抑制素(inhibins)、骨形成蛋白(BMPs)及苗勒抑制物(mullerian)等。Smads信號(hào)蛋白是一種在TGF-β超家族成員細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子[14]，可分為8個(gè)亞型，其中Smad1、Smad2、Smad3、Smad5 和 Smad8 屬于調(diào)節(jié)型(R-Smads)，Smad4 屬共同介導(dǎo)型(Co-Smads)，Smad6和Smad7屬于抑制型(I-Smads)。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，Smad2、3 可被 TGF-β1型受體和 activins活化，又稱為AR-Smads，它們通過(guò)磷酸化的方式開(kāi)始細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[15]。

本研究在原有的基礎(chǔ)上[8]進(jìn)一步證實(shí)，Sr在促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的過(guò)程中，明顯地促進(jìn)p-Smad2的表達(dá)和Runx2的表達(dá)。為了探討Sr促進(jìn)p-Smad2表達(dá)的分子機(jī)制，本文觀察了TGF-β1特異性阻斷劑SB431542對(duì)Sr促進(jìn)p-Smad2表達(dá)的影響。研究結(jié)果表明，SB431542能明顯抑制Sr對(duì)BMSCs p-Smad2表達(dá)的促進(jìn)作用，進(jìn)一步證實(shí) TGF-β1位于Smad2的上游，這與前文的報(bào)道[4-5]相一致，為了進(jìn)一步探討Smad2通路在Sr促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中的作用，本文應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默了BMSCs的 Smad2。研究結(jié)果表明，Smad2-siRNA不僅明顯地抑制了Sr對(duì)Runx2表達(dá)的上調(diào)作用，而且抑制了Sr對(duì)ALP活性及鈣結(jié)節(jié)數(shù)量的促進(jìn)作用，由于Runx2的表達(dá)是成骨細(xì)胞開(kāi)始分化的標(biāo)志，能誘導(dǎo)BMSCs發(fā)育成為成骨細(xì)胞。另一方面，ALP活性是成骨的早期指標(biāo)，而鈣結(jié)節(jié)形成是成骨的晚期指標(biāo)，因此，本研究結(jié)果表明Smad2通路在Sr促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中起著重要的作用。

綜上所述，本文證實(shí)了Sr可通過(guò)TGF-β1通路調(diào)節(jié)Smad2活動(dòng);激活TGF-β1-Smad2通路可能是Sr促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的重要機(jī)制之一。本文為深入闡明Sr的促成骨細(xì)胞機(jī)制提供了新穎的實(shí)驗(yàn)資料。

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