馮金，劉小勇

（柳州市柳鐵中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西柳州545007）

白血病細(xì)胞中NF-κB的活化狀態(tài)及其對細(xì)胞凋亡的影響

馮金，劉小勇

（柳州市柳鐵中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西柳州545007）

目的探討白血病細(xì)胞株中核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化狀態(tài)及其對白血病細(xì)胞凋亡的影響。方法流式細(xì)胞術(shù)檢測白血病細(xì)胞及對照組細(xì)胞PBMC凋亡率；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測各組細(xì)胞NF-κB相對活性；NF-κB抑制劑PDTC作用12 h后檢測各組白血病細(xì)胞NF-κB相對活性及細(xì)胞凋亡率的變化。此外，qPCR及Western Blot分別檢測各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax及Bcl-2的mRNA及蛋白水平的改變。結(jié)果與PBMC比較，各組白血病細(xì)胞凋亡率明顯下降(P＜0.05)；雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示各組白血病細(xì)胞的NF-κ B活性顯著高于PBMC(P＜0.05)；PDTC作用后各組白血病細(xì)胞NF-κB活性明顯下降，細(xì)胞凋亡率明顯升高(P＜0.05)；同時(shí)，各組白血病細(xì)胞Bax的mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯增高(P＜0.05)，而Bcl-2的表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)。結(jié)論白血病細(xì)胞中存在NF-κB的持續(xù)性激活，其激活可導(dǎo)致白血病細(xì)胞凋亡受阻。

白血病；NF-κB；細(xì)胞凋亡

白血病是一類造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病，是國內(nèi)十大高發(fā)惡性腫瘤之一，也是兒童和青少年發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤。改善這一類疾病的療效將極大提高人們的生活質(zhì)量。然而，臨床上白血病的化療常常出現(xiàn)耐藥，其可能與白血病細(xì)胞凋亡受阻有關(guān)[1]。多種實(shí)體腫瘤研究表明，核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Nuclear factor-kappa B，NF-κB)持續(xù)升高導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐受，是腫瘤耐藥的重要原因[2]。NF-κB是一類能與多種基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子κB位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合并促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。在正常造血細(xì)胞中，NF-κB信號(hào)通路通常處于非活化或低活化狀態(tài)[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，白血病細(xì)胞中有高表達(dá)的NF-κB[4]。那么，高表達(dá)的NF-κB是否介導(dǎo)了白血病細(xì)胞的凋亡受阻？為此，本課題通過檢測NF-κB在白血病細(xì)胞中的活化狀態(tài)，探討其對白血病細(xì)胞凋亡的影響，以期為白血病的治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及質(zhì)粒人慢性髓性白血病急變K562細(xì)胞、人急性單核白血病THP-1細(xì)胞和急性早幼粒細(xì)胞白血病HL-60細(xì)胞均購自上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫，本室常規(guī)保存。取正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMC)為對照。海腎熒光素酶表達(dá)載體pRL-TK質(zhì)粒購自Promega公司；pNFκB-TA-luc質(zhì)粒購自碧云天生物科技研究所。

1.2 試劑胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；Ficoll淋巴細(xì)胞分離液購自上海Sangon生物工程公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒為中國凱基生物制品；xfectTM轉(zhuǎn)染試劑購于美國clontech公司；Dual-Luciferase Reporter Assay System試劑盒購自Promega公司；TRIzol、qPCR試劑盒購自Takara公司；小鼠抗人Bax、Bcl-2單抗購于美國bioworld公司；羊抗小鼠IgG抗體購于北京中杉金橋公司；比格烷二硫代氨基甲酸鹽(Pyrrolidine dithiocarbam-ate，PDTC)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)K562、THP-1和HL-60細(xì)胞均用含10%胎牛血清、青霉素(100 U/m1)、鏈霉素(100 U/m1)的RPMI 1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)于含5%CO2的37°C恒溫培養(yǎng)箱中，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用Ficoll密度梯度離心法分離出PBMC為對照。

1.3.2 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡收集對數(shù)生長期各組細(xì)胞(1～5)×105個(gè)，PBS洗滌3次后，重懸于500 μl反應(yīng)緩沖液中。于上述緩沖液中加入5 μl Annexin V-FITC并充分混勻；再加入5 μl PI染液，混勻；室溫避光反應(yīng)5～15 min，立即上流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3.3 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測細(xì)胞NF-κB活性將對數(shù)生長期各組細(xì)胞(8×105)接種于6孔板中，采用xfectTM轉(zhuǎn)染試劑將5 μg pNFκB-TA-luc質(zhì)粒及0.5 μg pRL-TK Vector(轉(zhuǎn)染效率內(nèi)參)共轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞，培養(yǎng)于含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中。轉(zhuǎn)染第48 h檢測各組熒光素酶的活性。根據(jù)Promega試劑盒Dual-Luciferase Reporter Assay System技術(shù)手冊進(jìn)行操作，以pRL-TK為內(nèi)參，通過Turner TD20/20 luminometer檢測儀檢測熒光強(qiáng)度。以蟲熒光素酶活性(pNFκB-TA-luc)和海腎熒光素酶活性(pRL-TK)的比值(FL/RL)來表示NF-κB相對活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3.4 qPCR檢測各組細(xì)胞Bax及Bcl-2的mRNA水平收集各組細(xì)胞，Trizol抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行PCR檢測。以人β-actin為內(nèi)參，qPCR法檢測各組細(xì)胞Bax及Bcl-2 mRNA的表達(dá)。反應(yīng)引物序列見表1。qPCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性30 s后，94℃10 s，55℃20 s，72°C 30 s，循環(huán)35次。循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行融解曲線分析。用2-△△CT值表示基因的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

表1 PCR反應(yīng)引物序列

1.3.5 Western blot檢測Bax及Bcl-2蛋白的表達(dá)收集對數(shù)生長期各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，Bradford法測蛋白濃度。取80 μg細(xì)胞蛋白提取液，用12%的分離膠分離蛋白質(zhì)，濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉4℃封閉3 h，分別與兔抗人Bax及Bcl-2單克隆抗體(1:500稀釋)4℃孵育過夜后，與二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，l:1 000稀釋)孵育1 h，洗滌后用化學(xué)發(fā)光進(jìn)行顯色。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

2 結(jié)果

2.1 流式檢測細(xì)胞凋亡率流式檢測K562、 THP-1、HL-60細(xì)胞及PBMC細(xì)胞凋亡率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三組白血病細(xì)胞的凋亡率分別為(2.15±0.35)%、(1.82± 0.42)%、(1.15±0.37)%，明顯低于與對照組細(xì)胞凋亡率的(5.78±0.39)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測白血病細(xì)胞的凋亡率

2.2 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測細(xì)胞NF-κB活性熒光素酶報(bào)告基因檢測K562、THP-1、HL-60細(xì)胞及PBMC細(xì)胞NF-κB相對活性的改變。，各組白血病細(xì)NF-κB活性分別為(1.54±0.45)、(1.62±0.37)、(1.49±0.55)，顯著高于對照組細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖2。

圖2 熒光素酶報(bào)告基因檢測白血病細(xì)胞NF-κB的相對活性

2.3 PDTC作用后白血病細(xì)胞NF-κB活性的改變用100 μmol/L的PDTC處理各組白血病細(xì)胞后12 h后雙熒光素酶報(bào)告基因檢測細(xì)胞NF-κB活性的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PDTC作用后各組細(xì)胞的NF-κB活性均顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3。

2.4 PDTC作用后的白血病細(xì)胞凋亡率的改變PDTC抑制白血病的NF-κB活性后是否影響各組細(xì)胞的凋亡？流式檢測PDTC處理12 h后白血病細(xì)胞凋亡率的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組細(xì)胞的凋亡率較抑制劑處理前顯著增高(P＜0.05)，見表2。

圖3 PDTC處理后白血病細(xì)胞NF-κB的相對活性

表2 PDTC處理白血病細(xì)胞凋亡率的改變

表2 PDTC處理白血病細(xì)胞凋亡率的改變

注：aP＜0.05，無PDTC處理組細(xì)胞與PDTC處理組細(xì)胞比較。

組別PDTC(-)PDTC(+) Bax Bcl-2 β-actin 2.15±0.35 1.82±0.42 1.15±0.37 6.23±0.73a4.18±0.27a4.55±0.31a

2.5 PDTC作用后白血病細(xì)胞及Bcl-2的mRNA水平的改變qPCR檢測PDTC作用前后各組白血病細(xì)胞Bax及Bcl-2 mRNA表達(dá)水平的改變。結(jié)果顯示：PDTC作用后，各組白血病細(xì)胞的Bax mRNA水平較藥物作用前均顯著增高，Bcl-2的表達(dá)在藥物作用后均明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖4。

圖4 PDTC作用后白血病細(xì)胞Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)水平的改變

2.6 PDTC作用后白血病細(xì)胞Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)的改變Western blot進(jìn)一步檢測各組白血病細(xì)胞在PDTC作用后Bax及Bcl-2蛋白水平的改變。與為未處理組比較，PDTC作用后，各組白細(xì)胞Bax的蛋白水平均顯著增高，而Bcl-2表達(dá)水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖5。

圖5 PDTC作用后白血病細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平的改變

3 討論

腫瘤細(xì)胞抵抗凋亡往往導(dǎo)致化療耐受[5]。探究這一類患者化療耐受的機(jī)制將極大提高該類人群的治療效果及生活質(zhì)量。已知NF-κB的持續(xù)性活化是導(dǎo)致多種腫瘤耐藥的主要原因[6]。本研究檢測了NF-κB在各類型白血病細(xì)胞中的表達(dá)狀態(tài)，并探討其表達(dá)對白血病細(xì)胞凋亡的影響，從而白血病的治療提供可能的策略。

實(shí)驗(yàn)中我們選取人慢性髓性白血病急變K562細(xì)胞、人急性單核白血病THP-1細(xì)胞和急性早幼粒細(xì)胞白血病HL-60細(xì)胞為研究對象，同時(shí)選取PBMC為對照，檢測各組細(xì)胞凋亡水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，各組白血病細(xì)胞明顯降低。我們進(jìn)一步檢測各組細(xì)胞NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的表達(dá)。結(jié)果顯示，各組白血病細(xì)胞的NF-κB轉(zhuǎn)錄活性較對照組明顯升高，提示白血病中持續(xù)性高表達(dá)的NF-κB可能是導(dǎo)致白血病細(xì)胞抵抗凋亡的原因之一。

為進(jìn)一步證實(shí)白血病細(xì)胞中活化的NF-κB導(dǎo)致細(xì)胞抵抗凋亡，將NF-κB信號(hào)的抑制劑PDTC處理各組白血病細(xì)胞。PDTC是一種具有抗氧化劑作用的、有效的NF-κB抑制劑[7]。本研究中，PDTC作用12 h后，各組白血病細(xì)胞的NF-κB活性明顯下降。進(jìn)一步檢測各組細(xì)胞凋亡率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組白血病細(xì)胞凋亡在PDTC處理后明顯增高。此外，我們還檢測各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)水平的改變。結(jié)果顯示，PDTC處理后白血病細(xì)胞Bax的mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯升高，而Bcl-2的表達(dá)水平明顯下降。以上結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)NF-κB活化抵抗了白血病細(xì)胞凋亡。

總之，在白血病中存在NF-κB的異常激活，其通過抵抗細(xì)胞凋亡而導(dǎo)致臨床上對白血病的治療預(yù)后差，這為臨床白血病的治療提供新的靶點(diǎn)。此外，本研究中的PDTC可下調(diào)NF-κB信號(hào)通路的活性，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示PDTC可能是治療白血病的一個(gè)有效途徑，有必要進(jìn)一步的研究與開發(fā)。

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Activation condition of NF-κB in leukemia cells and its effect on cellular apoptosis

FENG Jin,LIU Xiao-yong. Department of Laboratory Medicine,Liuzhou Municipal Liutie Central Hospital,Liuzhou 545007,Guangxi,CHINA

ObjectiveTo investigate the activation condition of NF-κB in leukemia cells and its effect on cellular apoptosis.MethodsFlow cytometry was used to detect the apoptosis of leukemia cells and peripheral blood mononuclear cell(PBMCs).The relative activities of NF-κB in the cells were assessed by luciferase reporter assays. After treated by PDTC(the inhibitor of NF-κB)for 12 h,the activation condition of NF-κB and apoptosis in leukemia cells were analyzed.In addition,the mRNA and protein expression of Bax and Bcl-2 were analyzed by qPCR and Western blot,respectively.ResultsCompared with PBMCs,cellular apoptosis in leukemia cells were significantly decreased(P＜0.05).The results of luciferase reporter showed that the relative activities of NF-κB were tly higher in leukemia cells than PBMCs(P＜0.05).Upon PDTC treatment for 12 h,the relative activities of NF-κB in leukemia cells were significantly decreased,while cellular apoptosis were significantly increased(P＜0.05).Additionally,the mRNA and protein expression of Bax in leukemia cells were significantly increased(P＜0.05),while the mRNA and protein expression of Bcl-2 were remarkably decreased(P＜0.05).ConclusionConstitutively activated NF-κB exists in the leukemia cells,and it's constitutively activation induces cellular apoptosis resistance.

Leukemia;NF-κB;Apoptosis

R733.7

A

1003—6350（2013）06—0785—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.06.0337

2012-10-30)