梁漢彰

(深圳市鹽田區(qū)人民醫(yī)院檢驗科深圳市第七人民醫(yī)院，廣東深圳518081)

PCR聯(lián)合RDB技術(shù)檢測β-地中海貧血基因結(jié)果分析

梁漢彰

(深圳市鹽田區(qū)人民醫(yī)院檢驗科深圳市第七人民醫(yī)院，廣東深圳518081)

目的探討PCR聯(lián)合RDB技術(shù)檢測β-地中海貧血基因的特異性和敏感性。方法選取在我院體檢的50例β-地中海貧血基因攜帶者，隨機分為兩組各25例，對照組采用RDB技術(shù)檢測，觀察組利用PCR聯(lián)合RDB技術(shù)檢測β-地中海貧血基因攜帶者標本，比較兩組患者的檢測結(jié)果并進行統(tǒng)計學分析其特異性和敏感性。結(jié)果觀察組患者在β-地中海貧血患者中，有11例患者β41-42(-TCTT)發(fā)生突變，約占44%，6例患者IVS-Ⅱ654(C→T)，約占24%，還有3例患者β17(A→T)發(fā)生改變，約占12%；TATA盒-28(A→T)的有2例，約占8%；β 71-72(+A)者1例，占4%；無法檢測的有2例，約占8%。對照組檢測率分別為32%、16%、12%、4%、8%和28%，兩組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論PCR聯(lián)合RDB技術(shù)檢測β-地中海貧血基因與單用RDB技術(shù)檢測相比較具有更高敏感性、特異性；同時聯(lián)合檢查具有高通量和快速的特點，可同時檢測5個已知突變或未知突變；此外聯(lián)合檢查還可以進行質(zhì)量控制，與傳統(tǒng)檢測方法相比具有成本低的優(yōu)勢。

β-地中海貧血；基因；PCR技術(shù)；RDB技術(shù)

β地中海貧血是我國南方地區(qū)，特別是廣東、廣西地區(qū)高發(fā)的單基因遺傳病之一，高發(fā)人群攜帶率達3%~10%，其分子病理學基礎主要為β-珠蛋白基因的點突變、缺失和插入[1]。在深圳市特別是鹽田區(qū)，地中海貧血基因攜帶率達10.3%，其中β-地中海貧血基因攜帶率達3.4%[2]?；贾匦挺?地中海貧血患者目前尚無理想治療手段，只能通過定期輸血治療等維持生命，但由于經(jīng)濟等原因很多人根本無法進行骨髓移植等更高費用的治療。因此，只有通過婚檢和產(chǎn)前檢查，篩查無癥狀地中海貧血基因攜帶者，才能將患病兒童出生率降到最低。

目前臨床傳統(tǒng)應用的反向點雜交技術(shù)(Reverse dot blot，RDB)檢測β-地中海貧血存在檢測費用高，周期長，可能出現(xiàn)假陰性等缺點。近年來建立并得以迅速發(fā)展的PCR聯(lián)合RDB技術(shù)可自動檢測單堿基替代及小片段核苷酸的插入或缺失，它已被證實為高性價比的檢測技術(shù)[3]。本研究采用PCR聯(lián)合RDB技術(shù)對β-地中海貧血基因攜帶者進行檢測，以探討其特異性和敏感性，現(xiàn)將結(jié)果報道如下：

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2009年1月至2012年12月在我院體檢的β-地中海貧血基因攜帶者標本50例，隨機分為觀察組和對照組各25例。對照組中男性16例，女性9例，年齡23~43歲，平均(31.4±4.1)歲。觀察組中男性17例，女性8例，年齡21~42歲，平均(30.8±4.2)歲。兩組患者的年齡、性別、文化程度、生活習性差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器與試劑DA7600熒光定量PCR儀、DYY電泳儀、蛋白凝膠分析系統(tǒng)等主要儀器；α、β-地中海貧血基因診斷試劑盒；DNA提取液等。

1.2.2 檢測方法[4]50例地中海貧血篩查陽性者，對照組25例采用反向點雜交(RDB)技術(shù)方法；觀察組25例采用PCR結(jié)合RDB技術(shù)作基因診斷，確定地中海貧血基因缺失和點突變類型。同時對對照組患者的標本進行PCR聯(lián)合RDB第二次檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法所有數(shù)據(jù)均采用SPSS11.0軟件分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者不同檢測方法基因突變檢測率比較觀察組有11例患者β41-42(-TCTT)發(fā)生突變，約占44%，6例患者IVS-Ⅱ654(C→T)，約占24%，還有3例患者β17(A→T)發(fā)生改變，約占12%；TATA盒-28(A→T)的有2例，約占8%；β71-72(+A)者1例，占4%；無法檢測的有2例，約占8%。而對照組單純的使用RDB檢測，檢測率為72%，遠低于觀察組的92%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組患者基因突變檢測情況比較[例(%)]

2.2 對照組患者兩種方法檢測前后比較對照組患者的標本在使用RDB技術(shù)檢測后，再對標本進行PCR聯(lián)合RDB技術(shù)檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RDB技術(shù)檢測假陰性率較高，特異性較低，與聯(lián)合檢測比較，差異具有統(tǒng)計學意義，見表2。

表2 對照組患者兩種檢測方法檢測前后比較[例(%)]

2.3 兩組患者檢測時間和費用比較由于對照組每次檢測只能一個標本一次檢測，標本同時進行檢測，而PCR聯(lián)合后先對樣本進行電泳雜交，然后批量檢測，為對照組的10倍，大大節(jié)省了檢查的時間和成本。為患者早期的診斷和治療帶來了便利。

3 討論

地中海貧血又稱海洋性貧血，是一組遺傳性疾病。其發(fā)病機制是合成血紅蛋白的珠蛋白鏈減少或缺失導致血紅蛋白結(jié)構(gòu)異常，從而導致紅細胞變形，壽命縮短，并且可以提前被人體的肝脾等破壞，導致貧血甚至發(fā)育等異常。目前研究發(fā)現(xiàn)β-地貧基因突變較多，迄今已發(fā)現(xiàn)的突變點達100多種，國內(nèi)已發(fā)現(xiàn)28種。其中常見的突變有6種[5]：①β41-42(-TCTT)，約占45%；②IVS-Ⅱ654(C→T)，約占24%；③β17(A→T)；約占14%；④TATA盒-28(A→T)，約占9%；⑤β71-72 (+A)，約占2%；⑥β26(G→A)，即HbE26，約占2%。

DHPLC對基因突變的篩查，是應用離子反向液相色譜技術(shù)，通過獨特的DNA分離基質(zhì)，對特定的PCR擴増產(chǎn)物進行分離[6-7]。由于該技術(shù)具有準確、敏感、高通量、自動化的特點，已被臨床廣泛應用于基因診斷。該技術(shù)檢查可普及370多個基因[8]，目前研究顯示，其可成功篩選出早期乳腺癌、卵巢癌相關基因(BRC A1)的突變[9]，其功能被不斷開拓，已用于基因變異、細菌鑒定[10]等多方面應用。

本研究對對照組采取兩份樣本，一組采用RDB技術(shù)進行檢測，同時對另一份標本進行PCR聯(lián)合RDB檢測。將研究結(jié)果與目前臨床傳統(tǒng)應用的RDB進行分析比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCR聯(lián)合RDB檢測技術(shù)在β-地中海貧血基因攜帶者檢測方面具有較高的特異性和敏感性，而單用RDB技術(shù)檢測時CDs41-42 (-TCTT)出現(xiàn)假陰性率為16%，IVS-2-654(C→T)假陰性率為8%，TATAbox-28(A→G)假陰性率為4%，且RDB檢測時間長，每次只能一個標本檢測。而PCR聯(lián)合后先對樣本進行電泳雜交，然后批量檢測，大大節(jié)省了檢查的時間和成本[11]。

綜上所述，PCR聯(lián)合RDB技術(shù)檢測β-地中海貧血基因與RDB技術(shù)相比較具有更高敏感性、特異性，同時具有高通量和快速的特點，并可同時檢測5個已知突變，并可以檢測未知突變，同時還可以進行質(zhì)量控制，與傳統(tǒng)檢測方法比較具有成本低的優(yōu)勢。因此更能讓患者接受。

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Effect of PCR combined with RDB in the detection of β-thalassemia gene.

LIANG Han-zhang.Department of Clinical Laboratory,Shenzhen Yantian District People's Hospital(the Seventh People's Hospital of Shenzhen City), Shenzhen 518081,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo study the specificity and sensitivity of detecting β-thalassemia gene by PCR combined with RDB.MethodsFifty β-thalassemia gene carriers collected in our hospital were randomly divided intotwo groups.The control group(n=25)applied RDB technology for detection,while the observation group(n=25)used PCR and RDB for detection of β-thalassemia gene carriers.The detection results of the two groups were compared and statistically analyzed.The specificity,sensitivity were analyzed.ResultsOf these patients in the observation group, 11(44%)cases were β41-42(-TCTT),6(24%)cases were IVS-Ⅱ654(C→T),3(12%)cases were β17(A→T),2 (8%)cases were TATAboxes-28(A→T),1(4%)case was β71-72(+A),and 2(8%)cases were not detected,which were 32%,16%,12%,4%,8%and 28%in the control group.The specificity and sensitivity of PCR combined with RDB technology were higher,compared with RDB detection technology.ConclusionCompared with RDB,PCR combined with RDB in the detection of β-thalassemia gene has higher sensitivity,specificity,which is fast and with high throughput.It can simultaneously detect five known mutations or unknown mutation.Besides,it is easy for quality control,and has the advantages of low costs.

β-thalassemia;Gene;PCR;RDB

R556.6+1

A

1003—6350（2013）16—2403—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.16.0991

2013-03-28)

深圳市鹽田區(qū)科技計劃項目(編號：200761211)

梁漢彰。E-mail：lhz@163.com