宋敏國， 袁進(jìn)強(qiáng)， 楊仙玉， 張姝芳， 諸葛慧， 徐 躍

（浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院， 浙江 臨安311300）

胸腺素α 原（prothymosin α， ProTα）是一種在哺乳動物細(xì)胞中廣泛分布、 結(jié)構(gòu)保守的酸性小分子蛋白， 是胸腺素α1（thymosin α1， Tα1）的前體蛋白［1］。 胸腺素α 原在抗腫瘤方面具有顯著的作用， 如可降低鼠的膀胱癌發(fā)生率［2］， 抑制HeLa 細(xì)胞凋亡， 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生干擾素和白介素等［3］。 鑒于蟾酥、 蟾衣、 蟾皮等中藥材廣泛應(yīng)用于臨床抗腫瘤治療［4－5］， 本研究開展以日本蟾蜍Bufo japonicus formosus 皮膚cDNA 質(zhì)粒文庫為模板， 通過菌落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（colony polymerase chain reaction， colony PCR）篩選具有完整開放閱讀框（open reading frame， ORF）的全長cDNA 的工作。 本研究篩選到日本蟾蜍ProTα 全長cDNA 序列， 并運(yùn)用多種軟件對其編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析， 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹， 為進(jìn)一步研究日本蟾蜍ProTα 蛋白的功能及其藥物研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

日本蟾蜍皮膚cDNA 質(zhì)粒文庫通過材料轉(zhuǎn)讓協(xié)議， 由日本產(chǎn)業(yè)技術(shù)總合研究所（AIST， Tsu-kuba， Japan）授權(quán)浙江農(nóng)林大學(xué)使用（作者楊仙玉在日本AIST 博士后工作期間制備）。 該文庫使用的載體為pSD64TR，上游和下游克隆位點(diǎn)分別為EcoR I 和Xho I， 載體上游和下游引物為SP6（5′-ATTTAGGTGACACTATAGAA-3′）和S.D.A.（5′-TTATGTAGCTTAGAGACTC-3′）， cDNA 的長度介于500～2 000 bp。

大腸埃希菌Escherichia coli 感受態(tài)細(xì)胞DH5α， PCR 反應(yīng)試劑盒， 2×PCR 混合試劑（master mix）等購自天根生化科技有限公司， DNA 梯狀核酸片段（ladder）和質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。 引物合成與DNA 測序委托上海生工生物技術(shù)有限公司或上海桑尼生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 日本蟾蜍皮膚cDNA 質(zhì)粒文庫轉(zhuǎn)化 將cDNA 質(zhì)粒文庫0.2 μL 電擊轉(zhuǎn)化到E. coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中（40.0 μL）， 然后迅速加入37 ℃預(yù)熱的160.0 μL LB 培養(yǎng)液， 37 ℃恒溫振蕩復(fù)蘇45 min， 取2.0 μL 轉(zhuǎn)化液均勻涂布于LB 平板（含Amp+100 mg·L－1）， 并在37 ℃恒溫培養(yǎng)12～15 h。

1.2.2 全長cDNA 篩選 從平板上隨機(jī)挑取單菌落接種于10.0 μL 的LB 液體培養(yǎng)基中， 以此菌液為模板實(shí)施菌落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。 使用的引物是載體上游引物SP6 和自行設(shè)計的含ploy（T）的cDNA 下游引物（5′-AGATCTCTCGAGTTTTTTTTTTTT-3′）。 反應(yīng)體系如下： 菌液0.5 μL， 2×PCR master mix 5.0 μL， SP6和ploy（T）引物（2 μmol·L－1）各1.0 μL， 補(bǔ)加滅菌超純水至10.0 μL。 為了防止聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)期間的水分蒸發(fā)， 在反應(yīng)體系中補(bǔ)加礦物油10.0 μL。 反應(yīng)條件為： 94 ℃/5 min， （94 ℃/30 s， 50 ℃/30 s， 72 ℃/120 s）×30 循環(huán)， 72 ℃/8 min， 4 ℃/∞。 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)束后， 取5.0 μL PCR 產(chǎn)物經(jīng)10.0 g·kg－1瓊脂糖凝膠電泳分析， 將擴(kuò)增出介于500～2 000 bp 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物的菌落初步確定為陽性。

1.2.3 質(zhì)粒回收和DNA 測序 將通過菌落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)初步確定為陽性克隆的菌液0.2 μL 接種于3.5 mL LB 培養(yǎng)液中（含Amp+100 mg·L－1）， 在37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)12～15 h， 然后使用試劑盒進(jìn)行質(zhì)?；厥詹ζ溥M(jìn)行DNA 限制性內(nèi)切酶（EcoR I 和Xho I）消化（雙酶切）， 進(jìn)一步確定陽性克隆及質(zhì)粒濃度。 首先委托公司將陽性克隆質(zhì)粒使用載體上游引物（SP6）對cDNA 進(jìn)行正向測序。 測序結(jié)果利用DNAstar/EditSeq 查找cDNA 的完整開放閱讀框， 推導(dǎo)氨基酸序列， 對具有合理完整開放閱讀框的克隆繼續(xù)委托公司使用載體下游引物（S.D.A.）進(jìn)行反向測序。

1.2.4 序列分析 利用DNAstar/EditSeq 尋找完整開放閱讀框， 推導(dǎo)其編碼蛋白的氨基酸序列并分析其理化性質(zhì)， 運(yùn)用NCBI 的Blast 功能在GenBank 中查找并下載其他物種同源蛋白的氨基酸序列， 運(yùn)用MegAlign 7.1 軟件進(jìn)行同源性比較， 并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 cDNA 的篩選

將日本蟾蜍皮膚cDNA 質(zhì)粒文庫轉(zhuǎn)化E. coli 感受態(tài)細(xì)胞DH5α 獲得的菌落， 以SP6 和ploy（T）為引物， 實(shí)施菌落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。 10 g·kg－1瓊脂糖凝膠電泳分析顯示， 在1 500 bp 左右出現(xiàn)一特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條帶（圖1A， 箭頭所示）， 在500 bp 左右出現(xiàn)一非特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條帶。 將此菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和質(zhì)?；厥?， 并對質(zhì)粒進(jìn)行EcoR I 和Xho I 雙酶切和10 g·kg－1瓊脂糖凝膠電泳檢測， 結(jié)果顯示該質(zhì)粒含有1 500 bp 左右的cDNA（圖1B， 箭頭所示）， 與菌落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的結(jié)果吻合。 將此質(zhì)粒委托DNA 測序公司進(jìn)行了正、 反雙向測序。

2.2 序列分析

2.2.1 測序結(jié)果分析及其編碼蛋白的理化性質(zhì) 使用DNAstar/EditSeq 對測序結(jié)果進(jìn)行分析， 表明該cDNA 全長1 480 bp， ORF 為339 bp， 5′ 端125 bp 及3′ 端1 016 bp 的非翻譯區(qū)。 完整開放閱讀框中三磷酸腺嘌呤脫氧核糖核苷和三磷酸胸腺嘧啶脫氧核糖核苷（A+T）的質(zhì)分?jǐn)?shù)為53.10%， 三磷酸鳥嘌呤脫氧核糖核苷和三磷酸胞嘧啶脫氧核糖核苷（G+C）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為46.90%， 共編碼112個氨基酸（圖2）， 其中酸性氨基酸（D+E）55 個，大部分成簇集中于序列中部， 堿性氨基酸（R+K）13 個， 極性氨基酸（N， C， Q， S， T， Y）16個， 疏水性氨基酸18 個， 缺乏芳香族氨基酸和含硫氨基酸。 其等電點(diǎn)（PI）理論值為3.554， 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為12.345 kD， 是一種高度酸性的親水性多肽。 同源性比較發(fā)現(xiàn)， 該cDNA 編碼的蛋白與其他物種的ProTα 具有較高的同源性，故命名為日本蟾蜍ProTα。

圖1 pSD64TR-ProTα 菌落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物（A）和重組質(zhì)粒EcoRⅠ和Xho I 雙酶切（B）產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Figure 1 Agarose gel electrophoresis of colony PCR product （A）and enzyme digestion product of recombinant plasmid of pSD64TR-ProTα

圖2 日本蟾蜍ProTα 全長cDNA 序列及其ORF 編碼的氨基酸推導(dǎo)序列Figure 2 Full length cDNA of ProTα and its deduced amino acid sequence of Bufo japonicus formosus

2.2.2 氨基酸序列同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 將日本蟾蜍ProTα 氨基酸序列和美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站上的其他物種的ProTα 氨基酸序列進(jìn)行同源性比較。 結(jié)果顯示， 與食用蛙Rana esculenta 同源性高達(dá)82%， 與牛Bos taurus， 狨猴Callithrix jacchus， 智人Homo sapiens， 恒河獼猴Macaca mulatta， 小鼠Mus musculus， 穴兔Oryctolagus cuniculus， 黑猩猩Pan troglodytes， 食蟹猴Macaca fascicularis， 褐家鼠Rattus norvegicus， 大西洋鮭Salmo salar， 非洲爪蟾Xenopus laevis 等11 種動物的同源性為54%～73%（圖3）。 通過MegAlign 7.1 軟件鄰接法進(jìn)行不同物種的氨基酸序列比對以及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。9 種哺乳類動物分屬1 支， 日本蟾蜍和食用蛙等兩棲類分屬1 支， 大西洋鮭分屬1 支（圖4）。 整個進(jìn)化樹表明： ProTα 的進(jìn)化史遵循傳統(tǒng)動物進(jìn)化規(guī)律。

3 討論

圖3 不同物種間ProTα 氨基酸序列比對Figure 3 Multiple alignment of ProTα amino acid sequences among different species

圖4 日本蟾蜍與其他物種ProTα 的系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 4 Phylogenetic tree of ProTα among different species

本實(shí)驗(yàn)成功克隆到日本蟾蜍ProTα 的全長cDNA（圖1～2）， 編碼112 個氨基酸殘基組成的蛋白， 其中酸性氨基酸（D+E）55 個， 其等電點(diǎn)（PI）理論值為3.554， 甚至在中性pH 的溶液中也帶有大量負(fù)電荷，被認(rèn)為是真核生物中酸性最強(qiáng)的肽類之一［1］。 由于大量酸性氨基酸主要集中在其序列中部， 使得Pro-Tα不能形成高級結(jié)構(gòu)， 在生理?xiàng)l件下蛋白呈現(xiàn)無規(guī)則卷曲構(gòu)象， 即所謂的 “天然無結(jié)構(gòu)蛋白”［6－7］。 中部序列能和組蛋白H1 特異性相互作用， 是促進(jìn)細(xì)胞增殖的主要功能域［8－9］。 ProTα 缺乏含硫氨基酸和芳香族氨基酸， 不能在波長280 nm 處形成吸收峰［1］； 缺乏疏水性氨基酸， 不可能形成信號肽結(jié)構(gòu)， 也就不能以限定途徑分泌到胞外［1］。 現(xiàn)已明確ProTα 在細(xì)胞外具有抗腫瘤功能及其他免疫刺激功能， 但它如何分泌到胞外， 至今尚不明確， 有待進(jìn)一步深入研究。

ProTα 有2 個方面功能： 一是胞內(nèi)促進(jìn)細(xì)胞增殖。 ProTα 在肝癌、 乳癌、 結(jié)腸癌和胃癌細(xì)胞中高表達(dá)， 表明ProTα 與腫瘤細(xì)胞的增殖密切相關(guān)［10－13］。 這可能是由于在細(xì)胞周期中， ProTα 的高表達(dá)縮短了G1 期［14］。 二是胞外具有免疫刺激活性。 ProTα 在細(xì)胞外， 通過潛在的膜受體調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答， 促進(jìn)IFN-y，TNF-α， IL-2 等細(xì)胞因子的產(chǎn)生， 進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答， 從而產(chǎn)生抗腫瘤作用［1］。 另外ProTα作為免疫佐劑， 在小鼠體內(nèi)能夠維持較高的抗體滴度， 延長免疫保護(hù)的時間［15］。 最近有報道， CD8+ T細(xì)胞中的ProTα 能夠強(qiáng)烈抑制HIV-1［16］。

ProTα 已作為一種新型的抗瘤藥物進(jìn)人到臨床前期的研究階段［17］。 因此， 構(gòu)建合適的含ProTα 全長開放閱讀框（ORF）的表達(dá)載體， 大量生產(chǎn)ProTα 蛋白， 對今后ProTα 生物學(xué)功能的進(jìn)一步研究具有參考意義。

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