柯 楊，馬 瑜，沈瑩華，李 勃*

(1.陜西省微生物研究所，陜西西安 710043;2.陜西省農(nóng)藥管理鑒定所，陜西 西安 710003)

植物在生物或非生物因子的影響下，發(fā)生一系列形態(tài)、生理和生化上的病理變化，使其正常的生長發(fā)育被阻礙的現(xiàn)象，稱為植物病害。植物病害往往給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來重大的損失。據(jù)不完全統(tǒng)計，目前，全球每年由于昆蟲、病原菌以及線蟲侵染導(dǎo)致的作物損失接近總產(chǎn)量的三分之一左右，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1］。長期以來，植物病害的防治主要依賴于化學(xué)農(nóng)藥的使用。過去的幾十年間，化學(xué)農(nóng)藥在農(nóng)作物種植過程中起到了非常重要的作用，大大提高了農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)。然而，大量化學(xué)農(nóng)藥在帶來這些益處的同時，也造成了嚴(yán)重的問題，如污染土壤和水體、危害生物生存、損害人類健康［2］。因而，各國研究人員一直在探索新的控制作物病害的方法，來降低乃至替代化學(xué)農(nóng)藥的使用，來維護(hù)食品和環(huán)境安全，保護(hù)人類健康。存在于土壤中或植物體內(nèi)的一些微生物，自身對于環(huán)境無公害，又兼具控制病害乃至促進(jìn)植物生長的潛力，自身也可代謝產(chǎn)生具有抑菌效應(yīng)的物質(zhì)。因此，開發(fā)具有生防作用的微生物農(nóng)藥，成為一種有效的選擇。目前，農(nóng)桿菌屬(Agro-bacterium)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)生防菌的應(yīng)用占了多數(shù)［3］，是生防菌應(yīng)用研究的熱點。冬凌草(Rabdosia rubescens)，又名冰凌草，其學(xué)名為唇形科香茶菜屬植物碎米椏，為多年生草本植物，因其植株在冬季凝結(jié)薄如蟬翼、形態(tài)各異的蝶狀冰凌片而得名，廣泛分布于秦嶺東南部及太行山區(qū)，是我國特有的珍稀藥用植物［4］。本研究從秦嶺山區(qū)的野生冬凌草中篩選到1株內(nèi)生細(xì)菌，就該菌株的分離、篩選和鑒定及其對棉花枯萎病、甘薯干腐病、小麥赤霉病、果樹輪紋病等植物真菌病害的防治作用報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物 用于分離拮抗菌的冬凌草(Rabdosia rubescens(Hemsl.)H.Hara)，標(biāo)本采自河南省三門峽市盧氏縣官道口鎮(zhèn)(34°14'32″N，111°09'12″E)，海拔746 m的山坡上。

1.1.2 供試病原菌 本實驗所用甘薯干腐病(Fusarium oxysproum)、小麥赤霉病(Fusarium graminearum)、棉花枯萎病(Fusarium Wilt)、郁金香種球枯萎病(Fusarium proliferatum)、蘋果輪紋病(Macrophoma kuwatsukai)、黑斑病(Alternaria alternate)及稻褐紋病(Nigrospora oryzae)等病原菌，均由本實驗室從染病植株中分離獲得，現(xiàn)保藏于陜西省微生物菌種資源庫(SMRL)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離、純化 ①分離方法:參考文獻(xiàn)［5］的方法，將所采樣品以蒸餾水清洗干凈后自然晾干，用無菌處理的打孔器將葉片打孔成直徑約0.8 cm的小片，用無菌處理的枝剪將根和莖分別剪切成約0.5～1 cm的小段(兩端均需有切口)。采用三步法對組織塊進(jìn)行表面消毒，詳細(xì)方法如表1所示。消毒處理完畢后，立即將組織塊用無菌水漂洗3～4次，取最后一次清洗液500 μL轉(zhuǎn)入無菌培養(yǎng)皿，倒入PDA培養(yǎng)基，于28℃培養(yǎng)3 d，以檢測消毒是否徹底;②培養(yǎng)條件:將經(jīng)過表面消毒的組織塊轉(zhuǎn)接于MEA平板上，于28℃培養(yǎng)3～15 d，根據(jù)形態(tài)及顏色差異挑取不同菌落，純化后于斜面中保存、備用。

表1 表面消毒方法及處理時間(min)Table1 Procedures and Process times of surface sterilization(min)

1.2.2 拮抗菌的篩選與防效測定 將待篩選菌株斜面培養(yǎng)24 h后，加適量無菌水制備成菌懸液，并將菌懸液稀釋到108cfu/mL備用。取200 μL稀釋后的菌懸液加入營養(yǎng)瓊脂平板，涂布均勻后置于33℃培養(yǎng)24 h，然后在待測菌涂布平板上用6 mm打孔器打取菌片待用。預(yù)先取本實驗室保存的植物病原真菌，在PDA培養(yǎng)基上活化3～5 d后，用直徑5 mm的打孔器在菌落邊緣打孔取菌齡一致的菌片，菌絲向下轉(zhuǎn)接到新的PDA平板中央，在距該菌片2.25 cm處的3個點對稱接種分離的待測細(xì)菌菌片，同時以不接細(xì)菌作為對照，每處理3次重復(fù)，置于28℃培養(yǎng)3～5 d，測量對照菌落半徑及處理菌落半徑，計算抑菌率［6］。

1.2.3 拮抗菌的鑒定 ①形態(tài)觀察及理化測試:參照東秀珠等［7］及Gatson等［8］的方法進(jìn)行鑒定，并根據(jù)伯杰氏手冊［9］得到鑒定結(jié)果;②細(xì)菌基因組DNA提取與PCR擴(kuò)增:細(xì)菌基因組DNA的提取采用TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0(寶生物工程有限公司)試劑盒來進(jìn)行。16S rDNA序列的PCR擴(kuò)增采用通用引物:Primer F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';Primer R:5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGGA-3'。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件:95℃ 1 min;95℃ 1min，50℃1.5 min，72℃ 2 min，共35次循環(huán);72℃延伸 4 min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送華大基因科技有限公司進(jìn)行純化與序列測定;③分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析:采用NCBI網(wǎng)站上的Basic BLAST對所測得的DNA序列進(jìn)行同源性比對，并利用ClustalX 2.0［10］及MEGA 5.0［11］軟件采用N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 拮抗菌內(nèi)生性檢測 參考文獻(xiàn)［12-13］的方法，利用利福平標(biāo)記進(jìn)行回接測定。將供試菌株轉(zhuǎn)入含0.5 μg/mL利福平的NA平板培養(yǎng)基中，挑取生長的抗利福平突變體菌株，再接入相同利福平濃度的NA培養(yǎng)基中，重復(fù)上述步驟，直至篩選到在含有300 μg/mL利福平的NA培養(yǎng)基上能穩(wěn)定生長、并對病原真菌的拮抗作用不變的KD3突變體菌株。然后采用根部注射和土壤澆灌的方法接種KD3突變體菌株，以不接菌為空白對照，分別于第10天、第20天和第30天選取宿主植物的根、莖及葉片在含300 μg/mL利福平的NA培養(yǎng)基上進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌分離。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離

2.1.1 表面消毒效果的驗證 實驗發(fā)現(xiàn)，消毒后的組織塊最后一次清洗液倒入PDA培養(yǎng)基，經(jīng)28℃培養(yǎng)3 d后未出現(xiàn)菌落。說明表面消毒效果良好，排除環(huán)境及植株表面微生物污染的可能性。

2.1.2 分離結(jié)果 根據(jù)菌落特征、菌體形態(tài)特征及生理生化反應(yīng)的差異，從根、莖及葉中共分離得到22株不同類型的內(nèi)生細(xì)菌，經(jīng)初步鑒定分別屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)、雷爾氏菌屬(Ralstonia)、芽胞桿菌屬(Bacillus)等6種不同分類單元的內(nèi)生細(xì)菌。

2.2 拮抗菌的篩選與防效測定

2.2.1 篩選結(jié)果 采用三點對峙法對所分離到的菌株進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)有4株內(nèi)生菌對于不同病原菌具有一定的抑制作用。其中內(nèi)生菌KD3具有較廣泛的抗菌譜，尤其對鐮刀菌屬(Fusarium)及大莖點霉屬(Macrophoma)的病原菌具有顯著拮抗作用。

圖1 菌株KD3對病原菌的抑制作用Fig.1 Inhibition effect of the strain KD3 on pathogenic fungi

2.2.2 防效測定結(jié)果 菌株KD3對供試病原真菌抑制作用的結(jié)果見表2。

表2 KD3菌株對不同植物病原真菌的抑菌率Table2 Inhibition rate of KD3 to different plant pathogenic fungi

由表2中數(shù)據(jù)可知，KD3對小麥赤霉病的抑菌率較低，對果樹輪紋病的抑菌率最高，對供試病原真菌的抑菌率在50%～80%之間，說明該菌株具有較廣的抑菌譜。

2.3 拮抗菌的鑒定

2.3.1 拮抗菌的生理生化鑒定 菌株KD3的革蘭染色呈陽性，桿狀，單個或成對排列，芽胞中生或近中生，孢子囊無明顯膨脹。在營養(yǎng)瓊脂上生長時，菌落為近圓形，邊緣不規(guī)則，表面呈乳白色，直徑2～3 mm。該菌株的生理生化鑒定結(jié)果如表3所示。

表3 菌株KD3的生理生化鑒定結(jié)果Table3 Physiological and biochemical characteristic of KD3

2.3.2 拮抗菌的分子生物學(xué)鑒定 菌株KD3的16S rDNA PCR產(chǎn)物長度為1.4 kb左右。該序列已在NCBI注冊，注冊號為JX993838。利用Basic BLAST將菌株KD3的16S rDNA序列和NCBI中已登錄的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較，對比結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株KD3與多株枯草芽胞桿菌(B.subtilis)及Bacillus tequilensis的16S rDNA核苷酸序列的同源性均在99.5%以上。利用MEGA5構(gòu)建的N-J法系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。結(jié)合生理生化鑒定和同源性比對及系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果，可認(rèn)定菌株A97為芽胞桿菌屬的枯草芽胞桿菌(B.subtilis)。

2.4 菌株KD3的內(nèi)生性檢測

通過利福平標(biāo)記菌株KD3后，獲得1株穩(wěn)定的突變體。將該突變株重新轉(zhuǎn)接入冬凌草根部后進(jìn)行再分離實驗。由表4結(jié)果可見，KD3突變株在接種冬凌草10 d后，在根部及莖部可分離到該突變菌株;到30 d后在葉片中也可分離到該突變株。說明該菌株能夠在宿主植物體內(nèi)有效定殖。

圖2 菌株KD3的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The phylogenetic tree of strain KD3

表4 菌株KD3內(nèi)生性檢測結(jié)果Table4 Endophytic test of strain KD3

3 討論

枯草芽胞桿菌具有多種優(yōu)良特性，如分布廣泛、生長快、抗逆性強(qiáng)、營養(yǎng)要求單一，對環(huán)境及人類具非致病性等［14］。此外，該菌亦可在其代謝過程中產(chǎn)生具有抑制植物病原菌效應(yīng)的脂肽類物質(zhì)，因而成為現(xiàn)代生物農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域的一個關(guān)注熱點，是當(dāng)前研究人員選育生防菌的重要來源之一［15］。目前，國內(nèi)外已有多種枯草芽胞桿菌生防制劑得到商業(yè)化應(yīng)用。拜耳作物科學(xué)公司應(yīng)用菌株B.subtilisGB03開發(fā)的第一個殺真菌劑—Kodiak，其有效成分可控制植物根際病害病原菌Alternaria、Aspergillus、Fusarium及Rhizoctonia，并獲準(zhǔn)應(yīng)用于小麥、大豆、大麥、玉米等多種農(nóng)作物。此后，各公司又開發(fā)出的HiStick、Biobest、Greenall G、Larminar及Companion等一系列枯草芽胞桿菌生防制劑，并在美國、歐洲以及亞太地區(qū)廣泛使用。

本研究從冬凌草組織中分離得到1株對多種植物真菌病害具有較好拮抗作用的細(xì)菌KD3，經(jīng)鑒定該菌株為枯草芽胞桿菌(B.subtilis)。通過三點對峙法的平板實驗方法，發(fā)現(xiàn)KD3對于多種植物病原菌具有抗性，尤其是針對鐮刀菌屬的作物土傳病害和以輪紋大莖點霉菌為代表的果實采后病害具有比較顯著拮抗作用。而且，作為一種植物內(nèi)生性的芽胞桿菌，KD3能夠在植物組織和葉際的微生態(tài)環(huán)境中迅速定殖生長，而其所產(chǎn)生的芽胞對于紫外線輻射、低溫、干燥等環(huán)境具有良好的耐受性。這些特性都是理想的采后病害生防菌的必要條件，因而具有良好的開發(fā)潛力。下一步將針對其抑菌機(jī)理以及該菌株的溫室及田間防效進(jìn)行研究，為開發(fā)新的芽胞桿菌生防制劑打下基礎(chǔ)。

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