劉艷琴，王浩，楊紅梅，郭啟雷，史海良，田艷玲

（國家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗中心，北京 100094）

雙酚A 簡稱雙酚基丙烷（BPA），在工業(yè)上雙酚A被用來合成聚碳酸酯（PC）和環(huán)氧樹脂等材料。聚碳酸酯是一種透明的硬塑料，它常用來作為單體合成聚碳酸酯塑料，這種材料可以用來加工成塑料接觸制品。雙酚A 可以通過包裝材料進(jìn)入食品或化妝品中，進(jìn)而進(jìn)入人體，造成人類和野生動物的內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)異常，還會嚴(yán)重干擾人類和動物的生殖遺傳功能。研究已經(jīng)證實，低劑量的BPA（10-7mol/L）即能引起支持細(xì)胞和精子細(xì)胞死亡。己烯雌酚是一種人工合成的雌性激素類藥物，常當(dāng)做性激素調(diào)節(jié)動物的生理功能，還被用作動物飼料添加劑，以促進(jìn)動物的生長。己烯雌酚是人工合成的非甾體雌激素，屬于雌激素及孕激素類藥物。它在促進(jìn)動物蛋白質(zhì)的合成代謝、提高動物日增重和減少脂肪等方面效果明顯，另外具有增加瘦肉率、排出死胎以及提高飼料轉(zhuǎn)化率等功能而廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)。將其添加到飼料里可以提高產(chǎn)崽率或催情作用，同時通過飼喂會使己烯雌酚殘留在牛奶中。國內(nèi)外研究表明，己烯雌酚可以破壞機(jī)體的遺傳物質(zhì)，導(dǎo)致基因突變，引發(fā)腫瘤。由于目前還沒有嬰幼兒配方乳粉中雙酚A 和己烯雌酚殘留的國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，還不能完成科學(xué)監(jiān)管，保護(hù)廣大嬰幼兒的健康和利益。因此，及時尋求簡便、快速、準(zhǔn)確、敏感性高的嬰幼兒配方乳粉中雙酚A 和己烯雌酚殘留的檢測方法才能保障食用嬰幼兒配方乳粉的衛(wèi)生和安全。

目前，測定雙酚A 和己烯雌酚殘留的文獻(xiàn)比較多，方法主要是氣相-質(zhì)聯(lián)用法[1-4]、高效液相色譜法[5-8]和液相-質(zhì)聯(lián)用法等[9-12]。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法存在前處理步驟繁瑣、有機(jī)試劑消耗量大、測定周期長等缺點；液相色譜法雖然對儀器要求不高，但檢出限不高，而且不能滿足確證要求；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是近年來新興的檢測技術(shù)，由于其準(zhǔn)確、高效和高靈敏度，符合目前食品安全檢測所追求的快速高效的要求。目前還未見液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法用于同時檢測雙酚A 和己烯雌酚的報道。本文采用堿性乙腈提取目標(biāo)物，采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測，前處理簡單，靈敏度高，適合于嬰幼兒配方乳粉中雙酚A 和己烯雌酚殘留的同時快速檢測。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

甲醇和乙腈：色譜純，德國Fisher 公司；雙酚A，己烯雌酚：w≥99%，美國Sigma 公司；實驗所選用樣品為作者單位檢驗樣品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。Agilent 6410 型串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀，配Agilent1200型液相色譜儀：美國Agilent 公司；RE-2000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海市亞榮生化儀器廠；KQ-5200 型超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司；TGL-16M 型高速臺式冷凍離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Milli-Q 去離子水發(fā)生器：美國Milli-Q 公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別稱取適量的雙酚A 和己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品，分別用甲醇配成0.1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，該溶液在-18 ℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：用甲醇將標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成1.0 μg/mL。

空白樣品提取液：選擇陰性樣品，按1.5 操作。

基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：根據(jù)儀器的靈敏度和線性范圍，吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用空白樣品提取液配成系列濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 色譜分析條件

色譜柱：資生堂MGⅢ-C18柱，1.8 μm，2.1mm×150 mm。

條件：流速0.25 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量20 μL，流動相：甲醇（A）+10 mmoL/L 乙酸銨緩沖溶液（B）；梯度洗脫：0～3 min，B 保持80%，3 min～15 min，B 由80%線性遞減至5%，15 min～21 min，B 保持5%，21.0 min～20.1 min，B 由5%線性遞增至80%，21.1 min～25.0 min，B 保持80%。

1.4 質(zhì)譜分析條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：負(fù)離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)檢測；干燥氣：N2；霧化氣壓力：275.8 kPa；干燥氣溫度：325 ℃；干燥氣流速：8 L/min；汽化溫度：340 ℃。

1.5 樣品處理

稱取4.0 g 樣品，精確至0.01 g，置于100 mL 比色管中，加水35 mL，充分溶解后超聲提取5 min，再用含1%氨水的乙腈溶液定容。超聲波提取20 min，上清液經(jīng)濾紙過濾，吸取25 mL 濾液至100 mL 蒸發(fā)瓶內(nèi)，并將其接至旋轉(zhuǎn)器上，于45 ℃水浴中減壓蒸餾至1 mL左右，加含2 %氨水的甲醇溶液充分溶解后定容至5 mL，濾紙過濾后待測（如渾濁嚴(yán)重，以8 000 r/min 高速離心10 min，取上清液過濾膜）。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理條件選擇

為了充分提取樣品中雙酚A 和己烯雌酚殘留，本實驗首先分別選擇乙腈、甲醇、乙酸乙酯等做為樣品提取溶液，試驗結(jié)果均不理想，隨后經(jīng)過反復(fù)試驗，發(fā)現(xiàn)含1%氨水的乙腈能有效地提取樣品中目標(biāo)化合物，同時能有效除去樣品中的蛋白質(zhì)，因此，選擇此溶液作為樣品提取液。此外，實驗還發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)定容溶液為堿性時，才能充分溶解目標(biāo)化合物，所以本方法選擇含2%氨水的甲醇溶液作為樣品的定容溶液。

2.2 基質(zhì)效應(yīng)的影響

化學(xué)分析中，基質(zhì)指的是樣品中被分析物以外的組分?；|(zhì)常常對分析物的分析過程有顯著的干擾，并影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。為了消除測定液中存在的基質(zhì)效應(yīng)，考慮到雙酚A 和己烯雌酚為ESI 負(fù)電離模式，采用含2%氨水的甲醇溶液作為樣品溶解液，很大程度上減小了測定液中的基質(zhì)效應(yīng)，同時提高了檢測靈敏度。分別用空白樣品測定液及含2%氨水的甲醇溶液配制成濃度為0.01 μg/mL 雙酚A 和己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過二者響應(yīng)值的比較來確定基質(zhì)效應(yīng)。實驗發(fā)現(xiàn)，雙酚A 和己烯雌酚的基質(zhì)效應(yīng)分別為74.5%和70.8%，這說明實際樣品中的基質(zhì)效應(yīng)不會對雙酚A 和己烯雌酚的定性定量測定造成較大的干擾。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

色譜柱的選擇：為了有利于色譜峰的分離及鋒形的改善，本方法分別采用資生堂MGⅢ-C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）、ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱和ZORBAX SB-Aq 色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）進(jìn)行分離試驗，發(fā)現(xiàn)資生堂MGⅢ-C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）效果較好。

流動相的選擇：實驗發(fā)現(xiàn)用水作水相流動相時，雙酚A 色譜峰易展寬，因此本方法采用10 mmoL/L 乙酸銨溶液-甲醇為流動相，利用梯度洗脫的方法提高分離及檢測效果效果，測試開始時，流動相中10 mmoL/L乙酸銨溶液-甲醇的比例為80 ∶20，然后在0～3 min 保持此將比例，這一部分主要是洗脫測定液中極性較強(qiáng)的雜質(zhì)，3 min～15 min 內(nèi)將改變二者的比例為5 ∶95，這一部分主要是洗脫測定液中的中等極性雜質(zhì)，15 min～21 min 保持此比例，這一部分主要是洗脫測定液中雙酚A 和己烯雌酚。通過上述兩步梯度，在21 min 內(nèi)，可以較好的分離測定液中雙酚A 和己烯雌酚，結(jié)果見圖1。

圖1 雙酚A 和己烯雌酚的加標(biāo)MRM 色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of a blank sample spiled with Bisphenol A and diethylstilbestrol

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用直接進(jìn)樣方式將濃度為100 ng/mL 的雙酚A和己烯雌酚注入離子源中，在負(fù)離子檢測方式下進(jìn)行母離子全掃描，得到雙酚A 和己烯雌酚的分子離子峰。根據(jù)歐盟2002/657/EC 指令規(guī)定對于質(zhì)譜確證方法必須達(dá)到4 個確證點的要求，低分辨液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測應(yīng)在確定母離子的基礎(chǔ)上選擇兩個以上的子離子。以該離子峰為母離子，進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，最后采集全掃描的二級質(zhì)譜圖，得到碎片離子信息，然后再對得到的二級質(zhì)譜參數(shù)如破碎電壓、碰撞能量等進(jìn)行優(yōu)化，使定性離子與定量離子產(chǎn)生的離子對強(qiáng)度比例達(dá)到最大時為最佳。得到雙酚A 和己烯雌酚的最佳質(zhì)譜參數(shù)，結(jié)果見表1。

2.5 線性關(guān)系及檢出限

用空白樣品提取溶逐級稀釋的標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別進(jìn)樣20 μL，測定結(jié)果經(jīng)線性回歸[y 為峰面積，Counts；x為濃度，（μg/L）]，同時用空白樣品進(jìn)行加標(biāo)實驗，在信噪比均大于3 的條件下能檢出，將此添加量定為檢出限，結(jié)果見表2。

表1 雙酚A 和己烯雌酚的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Parameters of mass spectra of Bisphenol A and diethylstilbestrol

表2 雙酚A 和己烯雌酚的線性方程、線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 2 The linear equation，correlation coefficient and limits of detection for Bisphenol A and diethylstilbestrol

從表2 可以看出，雙酚A 和己烯雌酚在1 μg/L～25 μg/L 濃度范圍內(nèi)高度線性相關(guān)（相關(guān)系數(shù)＞0.999），檢出限低（5 μg/kg），可以滿足實際檢測要求。

2.6 方法的回收率和精密度

每組準(zhǔn)確稱取空白樣品6 份，每份4.0 g，共3 組，分別定量加入雙酚A 和己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，添加水平分別為5、25、250 μg/kg。按供試品溶液制備方法制備后進(jìn)行測定，結(jié)果見表3。

表3 加標(biāo)樣品回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Recovery and relative standard deviation（RSD）of in spiled sample（n=6）

從表3 中可看出，不同濃度平均加標(biāo)回收率80.6 %～102.9%，平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.29%～8.83%（n=6）。圖1 為加標(biāo)樣品中MRM 色譜圖。

3 結(jié)論

建立了嬰幼兒配方乳粉中雙酚A 和己烯雌酚的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。該法樣品加標(biāo)回收率80.6%～102.9%，平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.29%～8.83%（n=6），方法的靈敏度和準(zhǔn)確度均滿足實際樣品檢測的需要。

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