王玥，劉秀梅，魏曉琨，朱玲

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457；2.上海斯貝生物科技有限公司，上海 200235）

D-塔格糖（D-tagatose）是一種低熱量與蔗糖甜度相近的食品甜味劑[1-2]。對其他甜味劑也有較好的協(xié)同增效作用[3]。D-塔格糖的生理功效體現(xiàn)在控制高血糖和糖尿病并發(fā)癥[4-5]、平衡腸道菌群[6]、預(yù)防齲齒[7]等方面。大量毒理試驗證明塔格糖安全無毒，國際上很多國家包括美國，新西蘭和澳大利亞以及中國，已批準(zhǔn)其在食品中廣泛應(yīng)用[8-9]。

截止到21 世紀(jì)初，D-塔格糖的制備主要有化學(xué)和生物兩種轉(zhuǎn)化方法?；瘜W(xué)轉(zhuǎn)化的問題是產(chǎn)物復(fù)雜難于與目標(biāo)產(chǎn)物分離[10]；生物轉(zhuǎn)化法包括發(fā)酵法和酶法[11]。發(fā)酵法周期長產(chǎn)量低，不適合工業(yè)擴大生產(chǎn)。酶法制備則是以D-半乳糖為原料，在L-阿拉伯糖異構(gòu)酶催化下進行轉(zhuǎn)化[12]。L-阿拉伯糖異構(gòu)酶由araA 基因編碼，參與L-阿拉伯糖的代謝。由于D-半乳糖和L-阿拉伯糖在三維結(jié)構(gòu)上相似，見圖1，因此L-阿拉伯糖異構(gòu)酶還能催化D-半乳糖生成D-塔格糖[13]。該酶在用于生產(chǎn)D-塔格糖中具有很大商業(yè)價值[14]。

圖1 L-阿拉伯糖異構(gòu)酶催化的反應(yīng)Fig.1 In vivo and in vitro reactions catalyzed by AI

本文采用DNA 重組技術(shù)構(gòu)建了一株高表達(dá)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的基因工程菌，將E.coli K12 基因組中的araA 基因插入載體pET-32a，并轉(zhuǎn)入宿主菌BL21（DE3）中高效表達(dá)，隨后對粗酶的酶活和最適酶活條件進行測定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

大腸桿菌K12（Escherichia coli）、大腸桿菌BL21（DE3）、載體pET-38a 為上海斯貝生物科技有限公司實驗室保存；pMD-18T 載體購自上海皓嘉科技發(fā)展有限公司。

1.1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶購自上海皓嘉科技發(fā)展有限公司；DNA 回收試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司并由該公司完成PCR 引物合成；2xTaq PCR MasterMix 購自天根生化科技有限公司；測序由上海英駿生物技術(shù)有限公司進行。其它試劑均為市售分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.2；固體培養(yǎng)基中添加1.5%的瓊脂；固體、液體LB 培養(yǎng)基使用時按需要添加氨芐青霉素（Amp，終濃度100 μg/mL）。

1.2 方法

1.2.1 araA 基因的PCR 擴增

根據(jù)GenBank 中大腸桿菌L-阿拉伯糖異構(gòu)酶（ECAI）基因序列設(shè)計PCR 引物，分別為araA（+）：GCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTT TAAGAAGGAGA TATACCATGACGATTTTTG，Xba I，rbs（點劃線）；araA（-）：GGAAGCTTTTAGCGACGAA ACCCGTAATA CAC TTCGTTC，Hind Ⅲ。

由于選用的酶切位點為Xba I 和Hind III，質(zhì)粒上的RNA 聚合酶結(jié)合位點被切除，故須在引物araA（+）處補入，，確保基因的正常轉(zhuǎn)錄。PCR 擴增的模板為大腸桿菌K12 基因組DNA，于94 ℃預(yù)變性5 min，變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)30 次，最后72 ℃延伸5 min。

1.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建以及目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)

將回收的PCR 產(chǎn)物連接到pMD-18T 載體上并轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α，篩選氨芐抗性的陽性克隆，經(jīng)測序正確，將目標(biāo)片段克隆到pET-32a 上，并轉(zhuǎn)化入E.coli BL21（DE3）中，篩選氨芐抗性的陽性克隆。將該陽性克隆菌株于37 ℃條件下置于50 μg/mL 氨芐霉素LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測得OD600達(dá)到0.4～0.6 時加入IPTG 至0.5 mmol/L，15 ℃誘導(dǎo)10 h，4 000 r/min 離心20 min，收集菌體，用50 mmol/L Tris-HC（lpH7.6）重懸菌體。誘導(dǎo)產(chǎn)物用12%的SDS-PAGE 分析。

1.2.3 L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的酶活測定

以重懸菌體為粗酶源、D-半乳糖作為酶活測定的底物，3 mL 酶活測定體系包括0.6 mL 菌懸液，0.4 g/L D -半乳糖，1 mmol/L MnCl2，50 mmol/L Tris -HCl（pH7.6）。60 ℃反應(yīng)1 h，每隔15 min 取樣0.5 mL 到0.5 mL 0.1 mol/L HCl 中，測定D-塔格糖含量。D-塔格糖含量的測定采用半胱氨酸－咔唑法[15]。在上述測定條件下，將每小時產(chǎn)生1 μg D-塔格糖所需的酶量定義為一個酶活單位（U）。

1.2.4 酶活最適條件的測定

根據(jù)上述酶活測定方法，分別從溫度、pH、二價金屬離子以及Mn2+濃度四個方面來研究酶活測定的最適條件。

溫度：分別在30、37、40、50、60、70 ℃下測定酶活，其中反應(yīng)體系pH 為7.6，離子為Mn2+。

pH：采用磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液（pH 4.92～8.18）和Tris-HCl 緩沖液（pH 7.10～9.00），在pH 6、pH 6.6、pH 7、pH 7.6、pH 8、pH 8.6、pH 9 條件下進行酶活測定。反應(yīng)溫度為60 ℃，離子為Mn2+。

二價金屬離子：在Mn2+、Co2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Ni2+、Zn2+、Cu2+存在下測定酶活，各離子濃度均為1 mmol/L，以不加入任何二價金屬離子所測定的酶活為對照。

Mn2+濃度：向重懸菌體中加入10 mmol/L EDTA 以去除金屬離子，37℃處理2h。離心去上清，再用50mmol/L Tris-HCl（pH7.6）重懸。酶活測定中分別加入0、1、3、5、7、9 mmol/L Mn2+來檢測Mn2+濃度對酶活的影響。以未經(jīng)EDTA 處理的酶的酶活為參照。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組質(zhì)粒pET-38a-araA 的構(gòu)建與鑒定

以大腸桿菌K12 基因組模板，經(jīng)PCR 擴增araA得到1 500 bp 左右的特異性條帶，其大小與理論預(yù)期一致。回收目標(biāo)條帶，直接連接到pMD-T 載體上，轉(zhuǎn)入到大腸桿菌DH5α，篩選氨芐抗性的陽性克隆，并測序。測序結(jié)果與GenBank 上公布的大腸桿菌K12 的araA 基因（EG10052）相比，第213 位的由T 變?yōu)镃，第1395 位由C 變化T。但是對照密碼子表，兩者都是第三位發(fā)生突變，前者由GAT 變成GAC，但其對應(yīng)的氨基酸未變，仍然為天冬氨酸；后者由TTC 變成TTT，對應(yīng)的氨基酸仍然為苯丙氨酸。因此，基因序列的突變并不影響目的蛋白的序列。

將T 載體雙酶切得到1 500 bp 左右的條帶克隆到質(zhì)粒pET-32a 上，獲得重組質(zhì)粒pET-32a-araA，轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21（DE3）中，篩選氨芐抗性的陽性克隆菌落，獲得重組araA 的工程菌AraA。

2.2 L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的誘導(dǎo)表達(dá)

將上述構(gòu)建的工程菌AraA，按材料與方法中所述進行培養(yǎng)及誘導(dǎo)，所得菌體經(jīng)超聲波破碎，并經(jīng)SDSPAGE 電泳，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 重組菌AraA SDS-PAGE 蛋白電泳圖Fig.2 SDS-PAGE result of expression product of araA

經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后，L-阿拉伯糖異構(gòu)酶在宿主菌E.coli BL21（DE3）中有顯著的表達(dá)，見圖2 的Line2、3，其大小約為56 kDa，與文獻(xiàn)報道的L-AI 的單體分子量（Mr=56 074 Da）大小一致。目的蛋白大部分為胞內(nèi)表達(dá)，離心沉淀中仍有少量包涵體存在，見圖2 的Line7。

對相同濃度的重懸菌體、重懸菌體破碎液、破碎上清和破碎沉淀進行酶活測定，結(jié)果見圖3。

圖3 不同類型酶源的活力比較Fig.3 The activity construction of suspension of AI

通過比較，重懸菌體的酶活最高，因此酶活測定時均采用重懸菌體作酶源。與重懸菌體相比，由于超聲破碎對酶活產(chǎn)生影響，導(dǎo)致菌體破碎液的酶活有一定下降。破碎液中的酶活完全來自于上清液中的可溶蛋白，這說明包涵體中的蛋白沒有活性。

2.3 最適酶活條件

2.3.1 溫度

按照酶活測定方法，在不同的溫度下考察重組菌的酶的活力，確定最適酶活溫度，結(jié)果見圖4。

圖4 溫度對酶活測定的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity of AI

從圖4 中可以看出，隨著溫度的增加，酶活不斷增大，在60 ℃時達(dá)到最大活力，最高酶活為746.8 U/mL，并設(shè)為100%作為對照。雖然大腸桿菌的最適生長溫度為37 ℃，可此時的酶活卻僅為最高酶活的43%。明顯不同于文獻(xiàn)[12-15]中所述的37 ℃為最適酶活溫度，即常溫菌中AI 的最適酶活溫度能夠達(dá)到嗜熱菌中AI 的最適酶活溫度。這是前所未有的。

2.3.2 pH

采用磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液（pH 6、pH 6.6、pH 7）和Tris-HCl 緩沖液（pH 7.6、pH 8、pH 8.6、pH 9），在不同pH 條件下對L-AI 進行酶活測定，結(jié)果見圖5。

圖5 pH 對酶活測定的影響Fig.5 Effect of pH on the activity of AI

從圖5 中可以看出，在酸性條件下，L-AI 具有極低的活力，因此L-AI 不適合在酸性條件下進行反應(yīng)。在堿性條件下，隨著pH 的逐漸增加，L-AI 活力逐漸下降。在pH7.6 時達(dá)到最高活力，最高活力為619.6 U/mL。

2.3.3 二價金屬離子

在Mn2+、Co2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Ni2+、Zn2+、Cu2+存在下測定酶活，各種離子濃度均為1 mmol/L，以不加入任何金屬離子所測定的酶活為對照，結(jié)果見圖6。

從圖6 中可以看出，測定中添加Mn2+、Co2+和Fe2+能明顯地提高酶活，且Mn2+最高，相對活力高達(dá)190%。Mg2+、Ca2+和Ni2+對提高酶活的影響不太明顯，而Zn2+和Cu2+卻抑制了酶活測定。其中不加入任何金屬離子時的酶活為304 U/mL，并設(shè)為100%作為對照。

圖6 金屬離子對酶活測定的影響Fig.6 Effect of divalent metallic ion on the activity of AI

2.3.4 Mn2+濃度

以EDTA 處理后的重懸菌體為酶源，分別加入0、1、3、5、7、9 mmol/L Mn2+來檢測Mn2+濃度對酶活的影響，結(jié)果見圖7。以未經(jīng)EDTA 處理的酶的酶活為參照（100%）。

圖7 Mn2+濃度對酶活測定的影響Fig.7 Effect of concentration of Mn2+on the activity of AI

從圖7 可以看出，經(jīng)過EDTA 處理后，酶完全沒有活性。加入Mn2+后，可以使EDTA 處理過的酶重新恢復(fù)活力。但活力恢復(fù)后，酶活并不隨著Mn2+濃度的增加而增加。這表明L-阿拉伯糖異構(gòu)酶需要Mn2+催化，而且加入Mn2+有助于提高酶活，但提高酶活的量是有限度的。其中未經(jīng)EDTA 處理的酶液的酶活為660 U/mL，并設(shè)為100%作為對照，活力恢復(fù)后的酶活均能達(dá)到590 U/mL 以上。

3 討論

本研究中選擇E.coli K12 基因組作為模板，用PCR 方法克隆得到L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因araA，并將其轉(zhuǎn)入表達(dá)載體pET-32a 中。基于表達(dá)載體上T7 lac 的強啟動表達(dá)功能，使得目的蛋白在宿主菌BL21（DE3）中得到很高的表達(dá)量。經(jīng)SDS-PAGE 分析，15 ℃誘導(dǎo)10 h 后，目的蛋白主要以可溶性蛋白形式存在于菌體中，而無活性的包涵體表達(dá)量極低。以重懸菌液為酶源、D-半乳糖為底物，測定了L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的最適酶活條件。其結(jié)果表明：酶的最適溫度為60 ℃，最適pH 為7.6，酶活測定中加入Mn2+能顯著提高酶活，1 mmol/L Mn2+能使酶活相對提高50%。

[1]Pil Kim.Current studies on biological tagatose production using Larabinose isomerase：a review and future perspective[J].Applied microbiology and biotechnology,2004,65(3)：243-249

[2]Levin GV.Tagatose,the new GRAS sweetener and health product[J].Journal of medicinal food,2002,5(1)：23-36

[3]Bertorelli AM,Czarnowski-Hill JV.Review of present and future use of nonnutritive sweeteners[J].Diabetes Educ,1990,16(5)：415-422

[4]梁敏,翟婭菲,鄒洋,等.新型甜味劑塔格糖的應(yīng)用及生產(chǎn)[J].食品與藥品,2011(3)：125-128

[5]Ercan-Fang N,Gannon M C,Rath V L.Integrated effects of multiple modulators on human liver glycogen phosphorylase a[J].Am physiol endocrinol metab,2002,283(1)：29-37

[6]Bertelsen H,Jesen BB,Buemann B.D-tagatose：a novel lowcalorie bulk sweetener with prebiotic properties[J].World review of nutrition and dietetics,1999,85：98-109

[7]Claire LK,Margaret HW,Vasilios HF.90-day oral toxicity study of D-tagatoseinrats[J].Regulatorytoxicologyandpharmacology,1999,29：1-10

[8]Burdock GA,Garabin I G.Generally recognized as safe (GRAS)：history and description[J].Toxico Lett,2004,150(1)：3-18

[9]Benjamin B,Soren T,Arne A.Human gastrointestinal tolerance to Dtagatose[J].Regulatory toxicology and pharmacology,1999,29(2)：71-77

[10]黃聞霞,江波,沐萬孟,等.化學(xué)法合成D-塔格糖的研究[J],食品工業(yè)科技,2008,1(1)：247-249

[11]Oh DK.Tagatose：properties,applications,,and biotechnological processes[J].Appl microbiol biotechnol,2007,76(1)：1-8

[12]Granstr?m TB,Takata G,Tokuda M,et al.Izumoring：a novel and complete strategy for bioproduction of rare sugars[J].J Biosci Bioeng,2004,97(2)：89-94

[13]Lee SJ,Lee DW,Choe EA,et al.Characterization of a Thermoacidophilic L-Arabinose Isomerase from Alicyclobacillus acidocaldarius：Role of Lys-269 in pH Optimum[J].Appl Envir Microbiol,2005,71(12)：7888-7896

[14]Levin GV.Tagatose,The new GRAS sweetener and health product[J].Med Food,2002,5(1)：23-36

[15]Dische Z,Borenfreund E.A new spectrophotometric method for the detection and determination of keto sugar and trioses[J].Journal of biological chemistry,1951,192(2)：583-587