劉 靜 陜西學(xué)前師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系（西安710100）

肝癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，目前針對其治療多采用放療或化療法，但這種傳統(tǒng)方法無法抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，在殺傷腫瘤細胞的同時對正常細胞也帶來不同程度的損害，多具有一定的不良反應(yīng)，嚴重影響患者生活質(zhì)量，預(yù)后較差［1，2］。枸杞多糖（Lycium barbarumpolysaccharides，LBP）是由枸杞子經(jīng)脫脂，水提等步驟獲得的蛋白多糖。近年來藥理研究表明，枸杞多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗突變、抗病毒、抗感染等多種生物活性［3］。其對于癌細胞不具有直接殺傷作用，而是通過中間宿主效應(yīng)，在多個層面，多條途徑上作用于免疫細胞，加強機體免疫功能，增加抗體的分泌，達到抑制或殺傷癌細胞的作用。本研究中將枸杞多糖作用于移植性肝癌的小鼠，探討枸杞多糖對肝癌的抑制作用。

1 資料與方法 1.1 實驗動物與瘤株 昆明種小鼠48只，清潔級，5～7周齡，體質(zhì)量（18.5±2.4）g，雌雄各半，由吉林省藥品檢驗所實驗動物部提供。原發(fā)性肝癌H22腹水型細胞株購自中科院藥物研究所。

1.2 藥物與試劑枸杞多糖購自上?？抵壅婢嗵怯邢薰?，批號20110211。環(huán)磷酰胺購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號110412132。

1.3 儀器 Olympus光學(xué)顯微鏡（日本）；LDZ－5低溫高速離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；Airtech 無菌超凈工作臺（蘇州富泰潔凈系統(tǒng)有限公司）；96孔培養(yǎng)板（美國COSFT）；TP－100天平（北京賽得利斯）。

1.4 模型制備 將健康小鼠隨機分為6組，每組8只：肝癌細胞接種方法為取醫(yī)用酒精消毒小鼠腋下皮膚，抽取已感染H22瘤株的小鼠新鮮腹水，于小鼠右側(cè)腋窩下接種0.1mL（約含H22瘤細胞4×106個），制備荷瘤小鼠模型。A 組為對照組，未接種肝癌細胞，接種同劑量生理鹽水。接種后，腹腔注射生理鹽水；B 組為模型組，接種肝癌細胞后，腹腔注射生理鹽水；C組為環(huán)磷酰胺組，在接種肝癌細胞后注射20mg／kg的環(huán)磷酰胺；D 組、E組、F組作為枸杞多糖高、中、低劑量組，接種肝癌細胞后，分別腹腔注射20mg／kg、10mg／kg、5mg／kg的枸杞多糖。

每組分別給藥4周，給藥結(jié)束后以眼球摘除法取血，分離血清，在酶標(biāo)儀上測定（波長為492nm）血清中TNF－α含量，復(fù)孔檢查，根據(jù)樣品OD 值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的TNF－α含量。

頸椎脫臼處死小鼠，取腫瘤組織，稱質(zhì)量，并將腫瘤組織置于甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，觀察病理學(xué)改變。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 本研究數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以（±s）表示，多樣本均數(shù)間比較采用One－way ANOVA 分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果 2.1 枸杞多糖對荷瘤小鼠TNF－α的影響由表1可知，枸杞多糖高、中、低劑量組（D、E、F組）TNF－α分泌較模型組（B組）相比，有顯著性升高（P ＜0.05），表明枸杞多糖對TNF－α分泌有促進作用，可增強直接殺傷或抑制腫瘤細胞的作用。

表1 各組小鼠TNF－α濃度比較（±s）

表1 各組小鼠TNF－α濃度比較（±s）

注：與B組比較，△P ＜0.05

組別例數(shù)TNF－α（ug／mL）A 組8 68.61±2.68△B組8 54.38±5.49 C組8 66.69±4.52△D 組8 71.77±5.43△E組8 76.48±3.46△F組8 79.19±3.45△

2.2 各組小鼠腫瘤體積與質(zhì)量的比較 枸杞多糖高、中、低劑量組（D、E、F 組）與模型組（B 組）相比，腫瘤體積明顯縮小，腫瘤質(zhì)量降低（P ＜0.05）。同時環(huán)磷酰胺組腫瘤體積亦有明顯減小，抑制腫瘤生長的作用與枸杞多糖高劑量組相比，基本接近，差異無顯著性意義。

表2 各組小鼠TNF－α濃度比較（±s）

表2 各組小鼠TNF－α濃度比較（±s）

注：與B組同項指標(biāo)相比，△P ＜0.05

組別例數(shù)腫瘤體積（mm3）腫瘤質(zhì)量（g）A 組8 0 0 B組8 984.32±47.28 4.68±0.38 C組8 619.47±38.59△2.53±0.54△D 組8 671.79±53.59△2.57±0.59△E組8 726.63±36.42△3.28±0.37△F組8 875.17±38.37△3.94±0.51△

2.3 腫瘤的組織學(xué)改變 Olympus 光學(xué)顯微鏡可見，枸杞多糖高劑量組與環(huán)磷酰胺組腫瘤壞死程度最為明顯，壞死范圍最廣；淋巴細胞與單核巨噬細胞浸潤更為明顯，且纖維組織增生也較為明顯。枸杞多糖中、低劑量組較模型組相比，腫瘤組織與正常組織交界處亦可見不同程度的淋巴細胞浸潤，但纖維組織增生不明顯。表明枸杞多糖高劑量與環(huán)磷酰胺可抑制癌瘤細胞，生成大量淋巴細胞與巨噬細胞，增強機體免疫功能。

3 討 論 原發(fā)性肝癌是臨床常見惡性腫瘤之一，其病死率較高，預(yù)后較差。手術(shù)切除病灶無法保證切除所有癌變細胞，同時無法控制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移［4］。而手術(shù)后的放療與化療的使用在殺傷癌變細胞的同時在一定程度上也損害了正常組織細胞，導(dǎo)致骨髓造血功能或免疫功能障礙，帶來較多的不良反應(yīng)。因此開辟新的治療途徑，尋求高效，低毒副作用的治療方法是目前研究中極為重視的問題。中藥治療腫瘤近年來得到了較大的關(guān)注并取得了不錯的進展。由于中藥毒副作用較低，可調(diào)節(jié)機體的免疫功能，因此開發(fā)中草藥在腫瘤治療中意義重大［5］。

枸杞多糖是枸杞的重要活性成分，經(jīng)研究表明，枸杞多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗衰老、抗腫瘤、降血脂、降血糖、清除氧自由基、延緩衰老、抗疲勞等功能。大量的試驗結(jié)果表明，枸杞多糖諸多功能的發(fā)揮源于其對機體的免疫調(diào)節(jié)作用。其對癌細胞并不具有直接抑制或殺傷作用，而是通過中間宿主效應(yīng)，即增強機體對癌瘤的免疫功能等途徑發(fā)揮抑制作用而實現(xiàn)的［6］。枸杞多糖可通過多條途徑、多個層面對免疫系統(tǒng)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，一方面能激活T、B 淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等免疫細胞，促進抗體的分泌。另一方面通過誘導(dǎo)自然殺傷細胞分泌γ－干擾素，增加巨噬細胞的吞噬功能，并促進白細胞介素與腫瘤壞死因子的分泌，加強機體的體液免疫功能，從而對免疫系統(tǒng)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［7］。

在本研究中，枸杞多糖對荷瘤小鼠中肝癌生長具有明顯的抑制作用。枸杞多糖不同劑量組腫瘤重量均低于腫瘤模型組，同時腫瘤體積亦明顯低于模型組。癌變部位組織學(xué)比較中，枸杞多糖高劑量組與環(huán)磷酰胺組的腫瘤壞死程度重且范圍廣，淋巴細胞與單核巨噬細胞浸潤更為明顯，且纖維組織增生也較為明顯。環(huán)磷酰胺作為一種廣譜的抗癌藥，在殺傷癌細胞的同時也會損傷快速增殖的正常細胞，因此其雖具有明顯的抑瘤作用，但不良反應(yīng)嚴重。枸杞多糖高劑量組與環(huán)磷酰胺對于腫瘤壞死程度的影響療效相當(dāng)，但其毒副作用小，因此更適于臨床應(yīng)用，是較為理想的抗腫瘤輔助治療藥物［8］。枸杞多糖對肝癌抑制作用的機制尚不明確，結(jié)合小鼠實驗研究提示可能與下列機制有關(guān)［9，10］：①枸杞多糖可對體液免疫起到調(diào)節(jié)作用，可提高小鼠淋巴細胞增殖，增加小鼠總T 細胞與T 細胞亞群，是降低的免疫細胞恢復(fù)至正常水平，相助增強淋巴細胞的轉(zhuǎn)化率與CTL的殺傷能力；②增強小鼠對單核巨噬細胞的調(diào)節(jié)，通過處理抗原與釋放可溶性因子對抗腫瘤方面起到重要作用。枸杞多糖可增強單核巨噬細胞的吞噬功能，促進巨噬細胞產(chǎn)生TNF，提高胞內(nèi)溶菌酶與超氧化物歧化酶的活性，進而溶解腫瘤細胞；③枸杞多糖可增加NK 細胞殺傷活性，增加白細胞數(shù)量，拮抗NK 細胞的活性降低，提高IL－2因子的場所，維持NK細胞活性；④誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生，促進巨噬細胞的受體與腫瘤細胞表面IgG 結(jié)合，發(fā)生特異性免疫而殺傷腫瘤細胞。

綜上所述，枸杞多糖對肝癌細胞的生長有明顯的抑制作用，能有效增強宿主的免疫能力，提高機體免疫殺傷能力。因此，枸杞多糖在抗肝癌藥物研發(fā)與臨床應(yīng)用上具有廣闊的前景。

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