譚 拯，李 勤，程 飚，余文林，熊 杰

皮膚是雌激素敏感器官[1]，雌激素參與了皮膚的許多生理及病理過(guò)程。人類(lèi)皮膚衰老與體內(nèi)性激素水平降低有關(guān)[2]。成纖維細(xì)胞是皮膚皺紋形成的主要效應(yīng)細(xì)胞，它的生物學(xué)特性改變決定了皮膚老化[3]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白( bone morphogenetic proteins, BMPs)是一種酸性多肽物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞的增生和分化具有重要調(diào)節(jié)作用[4]。目前，雌激素與BMP-2 相互作用的研究主要集中在骨組織，對(duì)二者在皮膚老化方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)人正常皮膚成纖維細(xì)胞，觀察雌激素對(duì)細(xì)胞中BMP-2 mRNA 表達(dá)的影響，探討B(tài)MP-2 在雌激素參與的皮膚衰老過(guò)程中可能起到的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源 本院整形外科門(mén)診常規(guī)手術(shù)切除的2 例健康成年男性眼部非皺紋皮膚。

1.1.2 試劑和設(shè)備 亞甲基雙丙烯酰胺（DMEM）、胎牛血清（Gibco）， Dispase Ⅱ、胰蛋白酶、Triton X100（Sigma）；Trizol 試劑及反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（Takala）、TaqDNA 聚合酶（Promega）、PCR 擴(kuò)增儀（Biometra）。

1.2 方法

1.2.1 人皮膚成纖維細(xì)胞分離 根據(jù)文獻(xiàn)[5,6]的方法分離人皮膚成纖維細(xì)胞（HSFB），具體操作步驟如下：①原代培養(yǎng)：用含青霉素和鏈霉素的PBS 將手術(shù)切除的正常皮膚沖洗3 次，每次約10 s，用血管鉗盡量去除皮下結(jié)締組織；其后用眼科剪將皮膚剪成小塊狀，真皮面朝下平鋪于平皿中，加入4 %蛋白酶Ⅱ 4 ℃條件下過(guò)夜；次日分離表皮、真皮，將真皮剪切成小塊，接種于培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5 %CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，另加入少量含20%優(yōu)等胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，次日加入足量培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，以后每3 d 換液1 次。②傳代：用0.25%胰酶、0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）消化約1 min，在顯微鏡下觀察細(xì)胞回縮變圓、細(xì)胞間隙增大后，加入含10%優(yōu)等胎牛血清的DMEM 終止消化，用吸管吹打細(xì)胞，以1∶3 比例傳代培養(yǎng)。③形態(tài)學(xué)觀察：利用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況及形態(tài)變化。第3 ～6 代細(xì)胞用于正式實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)共分兩組，對(duì)照組（加入PBS）和雌激素處理組。分別取不同代數(shù)的HSFB 做實(shí)驗(yàn)，每代取3 皿細(xì)胞作為重復(fù)實(shí)驗(yàn)。雌激素處理組在培養(yǎng)基中加入1×10-6mol/L 17-β-雌二醇刺激24 h后與對(duì)照組培養(yǎng)基同時(shí)提取RNA。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 引物設(shè)計(jì)與合成參考文獻(xiàn)[7]，BMP-2 基因引物序列由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，其上游序列為5’-CACCGACCCGTCAGCT-3’，下游序列為5’-ATGAATTCGGTTGACCAAT-3’。擴(kuò)增目的基因片段長(zhǎng)度532 bp；GAPDH 上游序列為5’-ATGGCGGGCCAATAAATT-3’，下游序列為5’-CCATAAGGGAACGGACGT-3’。擴(kuò)增目的基因片段長(zhǎng)度為178 bp。

1.2.3 細(xì)胞總RNA 提取 滅酶EP 管收集細(xì)胞上清保存?zhèn)溆?，用冷PBS 沖洗細(xì)胞2 次；加入 1 ml Trizol，吹打細(xì)胞至液體澄清（生化：搖動(dòng)混勻后室溫孵育10 min）；將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 ml 滅酶EP 管中，加入氯仿0.2 ml（1/5 Trizol 體積），劇烈震搖15 s，置室溫5 min；4 ℃、12 000×g（相對(duì)離心力12 300）離心15 min；小心收集上層水相約0.5 ml 置于另一1.5 ml 滅酶EP 管中；加入0.5 ml 異丙醇，用力搖勻，置室溫10 min；4 ℃、12 000×g 離心10 min，可見(jiàn)RNA 沉淀。倒棄上清，用濾紙吸干管口余液，加入預(yù)冷的75%滅酶異醇1 ml，用指輕彈管壁使 RNA 沉淀飄起。4 ℃、7 500×g（相對(duì)離心力7 700）離心5 min，沉淀即為總RNA；棄上清，真空干燥約4 min 或空氣中干燥5 ～10 min，加入20 μl（30 μl）DEPC 水。56 ℃水?。?0 min 助溶，取少量測(cè)A 值，其余-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄cDNA ①在0.5 ml 微量離心管中，加入總RNA 1 ～5 μg，補(bǔ)充適量的去離子水使總體積達(dá)11 μl。在管中加10 μmol/L T 重復(fù)寡核苷酸[Oligo(dT)]12 ～18 μl，輕輕混勻，離心。②70 ℃加熱10 min，立即將微量離心管插入冰浴中至少1 min。再加入下列試劑的混合物：10×PCR buffer 2 μl、25 mmol/L MgCl22 μl、10 mmol/L dNTP mix 1 μl、0.1 mol/L DTT 2 μl，輕輕混勻，離心。42 ℃孵育2 ～5 min。③加入Superscript Ⅱ1 μl ，在42 ℃水浴中孵育50 min。④于70 ℃加熱15 min 終止反應(yīng)。⑤加入RNase H 1 μl，37 ℃孵育20 min，降解殘留的RNA。-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 RT-PCR PCR 總反應(yīng)體系為25 μl，其中模板量為2 μl，引物濃度為0.5 μmol/L、0.1 mmol/L dNTP、1.25 U Taq 聚合酶和1×PCR 緩沖液。共循環(huán)數(shù)40次，其中BMP-2 每一循環(huán)包括：94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min 和68 ℃ 1 min； 3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）反應(yīng)條件同BMP-2。

1.2.6 凝膠電泳 PCR 產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳分析結(jié)果。凝膠成像分析系統(tǒng)（GSD-7500，美國(guó)）對(duì)PCR 擴(kuò)增條帶進(jìn)行圖像掃描，測(cè)吸光度值，用BMP-2與GAPDH 的比值表示BMP-2 mRNA 的相對(duì)含量。

1.2.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)雌激素、BMP-2 對(duì)成纖維細(xì)胞周期的影響 將第3 代培養(yǎng)細(xì)胞常規(guī)消化，用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1×108/L，接種于6 孔培養(yǎng)板， 每孔2 ml 培養(yǎng)24 h。該實(shí)驗(yàn)總共分3 組，對(duì)照組、雌激素組和BMP-2 組，分別取第3 代后不同代數(shù)的培養(yǎng)細(xì)胞共3 代，每代細(xì)胞取3 皿細(xì)胞作重復(fù)實(shí)驗(yàn)。用70%乙醇將17-β-雌二醇稀釋成1×10-6mol/L，分別取2 μl 加入含2 ml 培養(yǎng)基的培養(yǎng)板內(nèi)。對(duì)照組采用PBS 替代，而B(niǎo)MP-2 組BMP-2 濃度根據(jù)文獻(xiàn)研究采取0.4 μg/ml。繼續(xù)培養(yǎng)至倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)接近80% 后終止培養(yǎng)，常規(guī)胰酶消化、PBS 洗滌、75%冷乙醇固定后，在流式細(xì)胞儀（Elite，貝克曼庫(kù)爾特公司，美國(guó)）上檢測(cè)各雌激素濃度組的細(xì)胞周期時(shí)相細(xì)胞比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用配對(duì)t 檢驗(yàn)，多組間比較采用Oneway ANOVA 方法進(jìn)行，P ＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HSFB原代培養(yǎng)

顯微鏡下觀察成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)良好，為長(zhǎng)梭形。

2.2 不同刺激組HSFB的周期分布

成纖維細(xì)胞在濃度為1×10-6mol/L 的17-β-雌二醇和0.4 μg/ml 的BMP-2 作用下，處于S 期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)明顯上升，增生指數(shù)與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；雌激素處理組處于S 期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)也較BMP-2 組增加（P ＜0.05）（表1）。

表1 不同刺激組HSFB的周期分布

2.3 PCR產(chǎn)物和瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

PCR 產(chǎn)物和瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1，產(chǎn)物片段大小與待擴(kuò)增的基因片段長(zhǎng)度相一致。雌激素組BMP-2 mRNA 相對(duì)值為8.43±0.43，而對(duì)照組BMP-2 mRNA 相對(duì)值為4.65±0.32，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。

圖1 BMP-2和GAPDH基因產(chǎn)物PCR擴(kuò)增圖

3 討論

皮膚衰老主要表現(xiàn)為皮膚的膠原纖維和基質(zhì)結(jié)構(gòu)以及代謝發(fā)生改變，出現(xiàn)膠原交聯(lián)、溶解性下降、脂褐素堆積、血管彈性下降，從而發(fā)生皮膚松弛變薄、色斑產(chǎn)生等一系列變化。皮膚衰老受年齡、外部環(huán)境及體內(nèi)激素水平的影響[8]。皮膚是一個(gè)雌激素敏感器官[1]，雌激素參與了皮膚的許多生理及病理過(guò)程，人類(lèi)皮膚衰老與體內(nèi)性激素水平降低有關(guān)，但二者間的內(nèi)在聯(lián)系和機(jī)制目前尚不十分清楚。有研究表明，雌激素可通過(guò)成纖維細(xì)胞上的受體直接調(diào)控該細(xì)胞的增生，提高其活性，增加膠原含量[7,9,10]。另外，通過(guò)皮膚上的雌激素受體，雌激素也可以刺激角質(zhì)形成細(xì)胞增生，增加和保持真皮中的膠原蛋白，減少基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的表達(dá)，增加真皮中黏多糖和透明質(zhì)酸的含量[11]，從而保持皮膚厚度、彈性及水分，并保證角質(zhì)層的屏障功能。

BMPs 屬于TGF -β 超家族，在胚胎發(fā)生和發(fā)育、組織與細(xì)胞的分化和增生等方面起重要作用[4]。研究表明，雌激素可以上調(diào)成骨細(xì)胞系MN7 細(xì)胞BMP-2 mRNA 的表達(dá)[12,13]。

雌激素對(duì)HSFB 增生的影響與其濃度有關(guān)。周武等[14]發(fā)現(xiàn)，雌激素的濃度為1×10-6～1×10-10mol/L時(shí)，可明顯促進(jìn)HSFB 的增生；但雌激素濃度＞10-6mol/ L 時(shí)，其對(duì)細(xì)胞增生有抑制作用，濃度＜ 1×10-12mol/ L 時(shí)，對(duì)細(xì)胞增生無(wú)影響。與雌激素相同，BMP-2 對(duì)HSFB 增生的影響也與濃度有關(guān)。鄧廉夫等[15]發(fā)現(xiàn)，BMP-2 濃度在0.4 μg/ml 時(shí)成纖維細(xì)胞增生迅速，因此本實(shí)驗(yàn)選取該濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。我們發(fā)現(xiàn)，用雌二醇和BMP-2 刺激培養(yǎng)細(xì)胞后，處于S 期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)明顯上升，其中雌激素組高于BMP-2組。該結(jié)果表明，雌激素與BMP-2 均可促進(jìn)HSFB增生。另雌激素刺激后，培養(yǎng)細(xì)胞BMP-2 mRNA 表達(dá)增加，表明雌激素刺激可有效增加細(xì)胞BMP-2 表達(dá)，而B(niǎo)MP-2 表達(dá)增加可促進(jìn)HSFB 增生。因此，本研究推測(cè)，BMP-2 有可能是雌激素刺激后的一個(gè)下游分子，雌激素有可能通過(guò)BMP-2 上調(diào)成纖維細(xì)胞活性，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增生及增加膠原含量，從而成為延緩由于激素缺乏引起的皮膚衰老的重要機(jī)制之一。但因目前尚未見(jiàn)對(duì)于雌激素、BMP-2 及皮膚相關(guān)性研究，未來(lái)實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)集中在雌激素刺激成纖維細(xì)胞后BMP-2 表達(dá)、BMP-2 下游通路及BMP-2 下游通路激活后成纖維細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的改變等方面。

[1] Emmerson E, Hardman MJ. The role of estrogen deficiency in skin ageing and wound healing [J]. Biogerontology, 2012, 13(1): 3-20.

[2] Sumino H, Ichikawa S, Abe M, et al. Effects of aging and postmenopausal hypoestrogenism on skin elasticity and bone mineral density in Japanese women [J]. Endocr J, 2004, 51(2): 159-164.

[3] 王曦. 成纖維細(xì)胞與皮膚老化 [J]. 中國(guó)美容醫(yī)學(xué), 2005, 14(2) : 243-245.

[4] Conway SJ, Doetschman T, Azhar M. The inter-relationship of periostin, TGF beta, and BMP in heart valve development and valvular heart diseases [J]. Scientific World Journal, 2011, 11:1509-1524.

[5] 馬英智, 張麗紅, 孫梅, 等. 人真皮成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定 [J]. 中國(guó)老年學(xué)雜志, 2009, 29(16):2005-2007.

[6] 趙利媛. 幾種藥物對(duì)體外培養(yǎng)人成纖維細(xì)胞MMP-1、MMP-12及LOX基因表達(dá)的影響 [D]. 天津: 天津醫(yī)科大學(xué), 2010:18-20.

[7] Shu YY, Maibach HI. Estrogen and skin: therapeutic options [J]. Am J Clin Dermatol, 2011, 12(5):297-311.

[8] Venable ME, Obeid LM. Phospholipase D in cellular senescence [J]. Biochim Biophys Acta, 1999, 1439(2):291-298.

[9] Shah MG, Maibach HI. Estrogen and skin. An overview [J]. Am J Clin Dermatol, 2001, 2(3):143-150.

[10] Stevenson S, Thornton J. Effect of estrogens on skin aging and the potential role of SERMs [J]. Clin Interv Aging, 2007, 2(3):283-297.

[11] Son ED, Lee JY, Lee S, et al. Topical application of 17betaestradiol increases extracellular matrix protein synthesis by stimulating tgf-Beta signaling in aged human skin in vivo [J]. J Invest Dermatol, 2005, 124(6):1149-1161.

[12] Peres JA, Lamano T. Strategies for stimulation of new bone formation: a critical review [J]. Braz Dent J, 2011, 22(6):443-448.

[13] Lissenberg-Thunnissen SN, de Gorter DJ, Sier CF, et al. Use and efficacy of bone morphogenetic proteins in fracture healing [J]. Int Orthop, 2011, 35(9):1271-1280.

[14] 周武, 盛晚香, 吳劍波, 等. 雌激素對(duì)人正常皮膚成纖維細(xì)胞的影響 [J]. 武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2008, 29(2):202-205.

[15] 鄧廉夫, 湯雪明, 柴本甫, 等. 腫瘤壞死因子-α和骨形成發(fā)生蛋白2誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞成骨表型表達(dá)的體外研究 [J]. 中國(guó)修復(fù)重建外科雜志, 1998, 12(4):236-240.