呂運通，王文嶺，楊蓉婭，夏志寬，李海濤，叢 林，王聰敏

阿薩希毛孢子菌（Trichosporon asahii，T. asahii）是毛孢子菌屬中最常見的深部致病菌，在免疫功能低下的宿主可導(dǎo)致致命的系統(tǒng)感染[1]。目前人們對T. asahii 生長調(diào)節(jié)的研究尚處于空白。近年來發(fā)現(xiàn)脂筏是細(xì)胞膜上富含膽固醇和鞘磷脂的微結(jié)構(gòu)域，是一種動態(tài)結(jié)構(gòu)，成簇的脂筏組成富含甾醇的區(qū)域（sterolrich domains，SRDs），這一區(qū)域就像一個蛋白質(zhì)停泊的平臺，與膜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、促進細(xì)胞的生長均有密切的關(guān)系[2]，其中包含控制細(xì)胞生長和毒力的蛋白糖磷脂酰肌醇錨定蛋白等[3]。本實驗應(yīng)用Filipin 熒光染劑對T. asahii 中的SRDs 區(qū)進行特異的熒光染色，以此來分析脂筏在調(diào)控T. asahii 菌絲生長、分支以及假菌絲繼續(xù)出芽生長等方面的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

T. asahii（CBS2479，CBS 公司），-80℃保存。Filipin熒光染色試劑盒（激發(fā)波長340 nm，GENMED 公司）。二甲基亞砜（DSMO，Sigma 公司）。兩性霉素B（Amersco 公司）。熒光顯微鏡（leica dm3000 數(shù)碼拍攝系統(tǒng)），UV 濾光片（Ex365/Em460）。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備 取濃度為106/ml的 2 ml菌種分別轉(zhuǎn)種于7個30 mlYPD液體培養(yǎng)基小三角燒瓶中，37 ℃，150 r/min培養(yǎng)，分別培養(yǎng)8 h、16 h、24 h、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d。

1.2.2 Filipin熒光染色 菌懸液離心后用清洗液A清洗，移除清洗液，重復(fù)兩次；然后取少量底層懸濁液滴在載玻片上，加固定液B固定30 min，移除固著液；加清洗液A清洗兩遍后移除清洗液；加水解液C水解1 h（避免干燥），移除水解液；清洗液A清洗兩遍后移除清洗液，加抗干擾液D10 min；加染色劑E并避光染色10～20 min。在熒光顯微鏡下觀察真菌形態(tài)及熒光分布。

1.2.3 兩性霉素B干預(yù) 將兩性霉素B粉末稀釋成0.2、0.5、1、2 μg/ml，分別加入到濃度為106cfu/ml菌懸液中搖菌72 h，注意避光。重復(fù)上述熒光染色步驟，在熒光顯微鏡下觀察真菌形態(tài)及熒光分布。

2 結(jié)果

2.1 正常培養(yǎng)條件下T. asahii熒光染色

8h、16h 后熒光顯微鏡下觀察視野中只有孢子和剛出芽的芽胞，隨機選擇視野觀察發(fā)現(xiàn)在孢子和芽胞頂端無明顯的熒光，僅細(xì)胞膜周圍有均勻彌漫的熒光（圖1a，1b）。24 h 時觀察視野內(nèi)大部分孢子已生長成菌絲，可觀察到菌絲的一端或兩端出現(xiàn)熒光，尚未觀察到隔膜熒光的出現(xiàn)（圖1c）。2、3、4、5、6、7 d 后視野中除可觀察到菌絲頂端熒光外，隔膜熒光開始出現(xiàn)（圖1d-1i）。

2.2 兩性霉素B干預(yù)后T.asahii熒光染色

T.asahii 經(jīng)不同濃度兩性霉素B 干預(yù)后通過Filipin 熒光，分別在普通光鏡和熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，隨著兩性霉素B 濃度的增加，菌絲的生長抑制程度越明顯，其頂端細(xì)胞膜和隔膜處熒光消失，而菌體內(nèi)出現(xiàn)散在熒光（圖2）。

3 討論

Filipin 是一種甾醇結(jié)合熒光染料，這種染料可以與真菌的SRDs 區(qū)特異性結(jié)合。在白念珠菌中，F(xiàn)ilipin 熒光可出現(xiàn)在菌絲生長的各個階段，包括菌絲的頂端和隔膜部位，而假菌絲中未觀察到熒光[4]。在T. asahii 生長過程中，我們不僅在菌絲的各生長階段的頂端和隔膜及分支部位觀察到了熒光，而且在假菌絲的兩端及隔膜、縮窄環(huán)部也觀察到了熒光。在前期研究中，在掃描電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)假菌絲的兩端可產(chǎn)生芽管和菌絲[5]；我們通過FM4-64 對T. asahii 熒光染色的方法發(fā)現(xiàn)假菌絲兩個頂端均出現(xiàn)較明顯的熒光[6]，說明T. asahii 的假菌絲具有轉(zhuǎn)化成菌絲的能力。本研究在T. asahii 的頂端、隔膜及分支部位觀察到了Filipin 熒光，這說明脂筏在調(diào)控T. asahii 的頂端生長及分枝生長方面起著重要作用。

圖1 不同培養(yǎng)時間T.asahii熒光染色

圖2 不同濃度兩性霉素B對T.asahii生長影響（3d，×100）

兩性霉素B 是多烯類抗真菌藥，可與真菌細(xì)胞膜上的甾醇結(jié)合，損傷膜的通透性、導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)重要物質(zhì)外漏，從而破壞細(xì)胞的正常代謝。經(jīng)過兩性霉素B 處理的T. asahii 形態(tài)發(fā)生較明顯的變化，且不同濃度的兩性霉素B 處理過的T. asahii 的形態(tài)變化差別也較明顯。隨著兩性霉素B 濃度的增加，T. asahii 的生長受到的抑制越明顯，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)隨著兩性霉素B 濃度增加，菌絲變得短粗，菌體膜的頂端缺乏較明顯的熒光，且觀察不到隔膜這一結(jié)構(gòu)，熒光主要分散在菌體的內(nèi)部，這也從另一角度證實了兩性霉素B 是通過干擾菌體內(nèi)的甾醇的轉(zhuǎn)運，從而影響菌體的生長。

真菌的極性生長是極其精細(xì)和復(fù)雜的過程，需要各組成成分相互協(xié)調(diào)、相互作用來完成。在細(xì)胞膜中成簇脂筏其間鑲嵌多種蛋白，Takeda和Chang[7]研究發(fā)現(xiàn)在裂殖酵母中，蛋白myo1、Cdc15 及其他的蛋白相結(jié)合為富含甾醇區(qū)域提供了支架，從而介導(dǎo)富含甾醇區(qū)域的形成。研究還發(fā)現(xiàn)在缺乏myo5 蛋白或Sla2 肌動蛋白相關(guān)蛋白的白念珠菌突變體中富含甾醇的區(qū)域無法形成[8]。Pearson 等[9]通過研究發(fā)現(xiàn)在構(gòu)巢曲霉中MesA 蛋白參與菌絲頂端富含甾醇區(qū)域的形成和成蛋白SepA 的定位。細(xì)胞膜上的脂筏結(jié)構(gòu)被破壞后，蛋白失去定位，可以看出，脂筏一旦被破壞，不僅會影響菌體的生長，同時也影響細(xì)胞膜上蛋白的功能。本研究僅是對T. asahii 的脂筏結(jié)構(gòu)用熒光染色的方法作了初步的觀察研究，從脂筏結(jié)構(gòu)角度來分析T. asahii 的極性生長，還需要更多針對性研究進一步證實。

[1] 楊蓉婭, 敖俊紅, 王文嶺, 等. 阿薩希絲孢酵母引起播散性毛孢子菌病國內(nèi)首例報告 [J]. 中華皮膚科雜志, 2001, 34(5):329-332.

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[7] Takeda T, Chang F. Role of fission yeast myosin I in organization of sterol-rich membrane domains [J]. Curr Biol, 2005, 15(14):1331-1336.

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