曹玲玲，何 超，薛建有，毛群銓，施鳴銘，戚武林，張世馥

(浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院蛋白質(zhì)組學(xué)與分子酶學(xué)研究室，浙江杭州 310018)

網(wǎng)織紅細(xì)胞是研究胞質(zhì)因子調(diào)控細(xì)胞分化的理想材料［1，2］，雖然細(xì)胞核已排出，但卻富含調(diào)控惡性腫瘤生長和逆轉(zhuǎn)的胞質(zhì)因子，細(xì)胞內(nèi)無溶酶體以及分裂相關(guān)的細(xì)胞器，卻又具有合成蛋白質(zhì)的能力，富含次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hypoxanthineguaninephosphoribosyltransferase，HGPRT)。網(wǎng)織紅細(xì)胞不同于使用細(xì)胞松弛素B處理產(chǎn)生的無核細(xì)胞［3］，這樣的處理使細(xì)胞受到損傷。因此，網(wǎng)織紅細(xì)胞在紅系終末分化的研究中具有重要的作用。由于正常體內(nèi)的網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)量較少，不易獲取足夠量的細(xì)胞，所以大都采用體外誘發(fā)的方法［4－6］。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同條件誘發(fā)的網(wǎng)織紅細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響很大，因此有必要對(duì)鹽酸苯肼誘發(fā)網(wǎng)織紅細(xì)胞的方法進(jìn)行優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)利用小鼠對(duì)鹽酸苯肼的注射劑量和注射時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，建立誘發(fā)網(wǎng)織紅細(xì)胞的最佳條件。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)織紅細(xì)胞的誘發(fā)

SPF級(jí)ICR雄性小鼠和BALB/c雄性小鼠［杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SCXK(浙2011-0048)］，體質(zhì)量均在25～35 g，鹽酸苯肼(華東醫(yī)藥股份有限公司)用0.85%氯化鈉注射液配成1%的工作液，避光保存，給實(shí)驗(yàn)組小鼠每天背部皮下注射1%鹽酸苯肼，劑量分別為:100、200、300 和400 μL，連續(xù)注射9 d，每組各5只。

1.2 網(wǎng)織紅細(xì)胞的獲取及煌焦油藍(lán)染色

每天經(jīng)尾靜脈取小鼠血約20 μL，重懸于200 μL無酚紅的RPMI-1640培養(yǎng)基中。染色時(shí)取20 μL重懸細(xì)胞液與20 μL煌焦油藍(lán)(煌焦油藍(lán)，華東醫(yī)藥公司，配制成1%的染液:1 g煌焦油蘭，0.5 g檸檬酸三鈉，溶于100 mL 0.85%氯化鈉注射液中，溶解后過濾，保存)染液混合均勻，15 min后即可在顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 注射不同劑量藥物對(duì)動(dòng)物生存影響

ICR小鼠:注射100和200 μL藥物劑量的均存活;注射300 μL藥物劑量的于第6天全部死亡;注射400 μL藥物劑量的第4天全部死亡。BALB/c小鼠:注射100 μL藥物劑量的均存活;注射200 μL藥物劑量的于第6天全部死亡;注射300、400 μL藥物劑量的第3天全部死亡。

2.2 網(wǎng)織紅細(xì)胞誘發(fā)結(jié)果

2.2.1 注射劑量對(duì)網(wǎng)織紅細(xì)胞誘發(fā)率的影響:注射100和200 μL鹽酸苯肼的ICR小鼠網(wǎng)織紅細(xì)胞的最高誘發(fā)率分別55.25%±4.34%和83.16%±3.41%，且細(xì)胞狀態(tài)良好。300和400 μL劑量組的網(wǎng)織紅細(xì)胞最高誘發(fā)率分別76.41%±0.45%和68.51%±2.49%，動(dòng)物經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)，肝臟異常，顏色發(fā)暗，且脾臟腫大。此外，200 μL藥物劑量組網(wǎng)織紅細(xì)胞誘發(fā)率第4天最高，且大于100、300和400 μL藥物劑量組，但從第5天開始，外周血中網(wǎng)織紅細(xì)胞比例 (76.03%±0.99%)開始下降，成熟紅細(xì)胞數(shù)量增多。

2.2.2 注射時(shí)間對(duì)網(wǎng)織紅細(xì)胞誘發(fā)率的影響:注射第1～3天，網(wǎng)織紅細(xì)胞比例不斷增加，誘發(fā)效率高達(dá)76.41%±0.45%，第4和第5天很少或幾乎看不到正常成熟紅細(xì)胞，誘導(dǎo)率分別達(dá)到83.16% ±3.41%和76.03% ±0.99%，從第6天開始網(wǎng)織紅細(xì)胞比例逐漸降低，之后出現(xiàn)成熟紅細(xì)胞，網(wǎng)織紅細(xì)胞比例降到25.81% ±1.35%(圖1)。

圖1 小鼠紅細(xì)胞的煌焦油藍(lán)染色Fig 1 The red blood cells in mice by bright tar blue staining(×400)

3 討論

鹽酸苯肼是一種可以導(dǎo)致小鼠貧血的化學(xué)藥物，其作用于骨髓造血細(xì)胞，導(dǎo)致紅系分化進(jìn)程終止在網(wǎng)織紅細(xì)胞階段。不同的注射劑量，導(dǎo)致動(dòng)物的健康狀態(tài)有很大差別，從而影響網(wǎng)織紅細(xì)胞的細(xì)胞狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)中，注射高劑量(300和400 μL)的小鼠，1 d后兩眼發(fā)暗，雙耳、四肢和尾部均呈白色，尾部變得粗糙，整體表現(xiàn)出重度貧血癥狀，動(dòng)物經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)，肝臟異常，顏色發(fā)暗，且脾臟腫大。小鼠死亡的原因可能是過量的藥物使得肝、脾衰竭、壞死，結(jié)果與過量注射鹽酸苯肼的新西蘭大白兔類似。由于器官衰竭，健康狀況惡化，所誘發(fā)的網(wǎng)織紅細(xì)胞細(xì)胞狀態(tài)也不同于正常網(wǎng)織紅細(xì)胞，其細(xì)胞形態(tài)異常，呈不規(guī)則形狀。所以不適用于網(wǎng)織紅細(xì)胞的誘發(fā)。但實(shí)驗(yàn)中的低劑量組(100和200 μL)，小鼠雖表現(xiàn)出貧血癥狀，但健康狀況稍好，進(jìn)食、飲水均正常。所誘發(fā)的網(wǎng)織紅細(xì)胞經(jīng)煌焦油藍(lán)活體染色，細(xì)胞形態(tài)飽滿、呈規(guī)則的圓形，清晰可見顆粒狀的嗜堿性RNA顆粒。故采用低劑量藥物誘發(fā)的網(wǎng)織紅細(xì)胞細(xì)胞狀態(tài)良好。

從第6天開始，注射低劑量藥物的小鼠其外周血細(xì)胞發(fā)生改變，比例占多數(shù)的網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)量開始減少，逐漸出現(xiàn)形態(tài)比較正常的成熟紅細(xì)胞，且比例不斷升高，所以持續(xù)注射藥物的時(shí)間不宜過長。

在所有實(shí)驗(yàn)組中，誘發(fā)的網(wǎng)織紅細(xì)胞經(jīng)煌焦油藍(lán)活體染色均呈現(xiàn)顆粒狀。而正常紅系分化的網(wǎng)織紅細(xì)胞具有不同的階段:剛完成排核的網(wǎng)織紅細(xì)胞，煌焦油藍(lán)活體染色時(shí)，可見絲網(wǎng)狀物質(zhì);隨著網(wǎng)織紅細(xì)胞不斷成熟，染色時(shí)可見顆粒狀物質(zhì)增多，到比較成熟的階段，則完全是顆粒狀的物質(zhì)。這說明，采用鹽酸苯肼誘發(fā)的網(wǎng)織紅細(xì)胞是較為成熟的，并處于同一階段，重復(fù)性好。

實(shí)驗(yàn)中兩種品系的小鼠(遠(yuǎn)交系ICR和近交系BALB/c)對(duì)鹽酸苯肼敏感性不同，在相同體重、相同劑量的情況下，ICR小鼠耐藥性明顯高于BALB/c小鼠，但二者誘發(fā)的網(wǎng)織紅細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)沒有顯著差異。

［1］徐冰心，劉志國，高嬌，等.硝酸羥胺中毒小鼠網(wǎng)織紅細(xì)胞的變化及意義［J］.中國工業(yè)醫(yī)學(xué)，2011，2:124.

［2］薛社普，章靜波，費(fèi)仁仁，等.紅細(xì)胞分化(去核)因子對(duì)腫瘤細(xì)胞生長分化調(diào)控的研究［J］.中國腫瘤，1992，1:8.

［3］Prescott DM，Myerson D，Wallace J.Enucleation of mammalian cells with cytochalasin B［J］.Exp Cell Res，1972，71:480－485.

［4］劉友華，薛社普.胞質(zhì)因子對(duì)人早幼粒白血病細(xì)胞惡性表型和基因表達(dá)的調(diào)控作用［J］.中國科學(xué)，1987，8:853－864.

［5］J.S.博尼費(fèi)斯農(nóng)，M.達(dá)索，J.B.哈特佛德，等著.章靜波，方瑾，王海杰，等譯.精編細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南［M］.北京:科學(xué)出版社，2007:392－394.

［6］郭雙利，白龍川，顏卉君，等.紅細(xì)胞分化因子誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞排核過程中酪氨酸蛋白質(zhì)磷酸化的改變［J］.生物化學(xué)雜志，1997，13:210 －215.