吳 堃，李 輝，朱卓立，李生偉

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝膽外科，重慶400010)

肝細(xì)胞肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一。研究肝癌發(fā)病過程中相關(guān)基因的相互作用不僅有助于更深層理解肝癌發(fā)病機(jī)制，且有助于發(fā)現(xiàn)靶向治療的新靶點(diǎn)。

Wnt通路是由一系列癌基因和抑癌基因編碼的蛋白質(zhì)組成，其在調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育與腫瘤發(fā)生、發(fā)展等關(guān)鍵的生理、病理過程中起重要作用［1］。Wnt2是Wnt家族中的成員，近年來諸多研究已證實(shí)，Wnt2與結(jié)直腸癌、胃癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、惡性胸膜間皮瘤、乳腺癌、膠質(zhì)瘤和惡性黑色素瘤等的發(fā)生，發(fā)展有關(guān)［2－8］。

本研究探討Wnt2在原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)中的表達(dá)情況。同時，采用Wnt2基因特異性siRNA轉(zhuǎn)染的方法，抑制人肝癌HepG2細(xì)胞中該基因的表達(dá)，以探討Wnt2基因?qū)δ[瘤細(xì)胞的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝膽外科2010年11月—2011年10月間住院手術(shù)切除肝癌和配對癌旁組織(緊鄰癌組織)56對(經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為原發(fā)性肝細(xì)胞性肝癌)，同時收集正常肝組織20份(所獲標(biāo)本均獲得重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)書及患者知情同意書)。新鮮組織在手術(shù)離體后立即去掉壞死組織、血塊。將收集的標(biāo)本分為2份，1份于30 min內(nèi)以液氮冷凍，并置于－80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩Ａ?份放入10%甲醛固定。人肝癌HepG2細(xì)胞由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室所保存。

1.2 主要試劑

Trizol試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR?Green試劑盒(TAKARA公司);免疫組化試劑盒及DAB顯色劑(重慶邁凱科技有限公司);Wnt2多克隆抗體、siRNA-Wnt2(Santa cruz公司);蛋白質(zhì)提取試劑盒及蛋白濃度測定試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展公司);ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Thermo公司);LipofectamineTM2000(Invetrogen公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 熒光定量PCR檢測Wnt2 mRNA表達(dá):步驟:采用引物設(shè)計軟件(Primer 5.0)進(jìn)行引物序列設(shè)計:Wnt2上游引物:5'-CGGGAATCTGCCTTTGTTT A-3'，下游引物:5'-TTCCTTTCCTTTGCATCCAC-3'，內(nèi)參基因GAPDH上游引物:5'-CGACCACTTTGTCA AGCTCA-3'，下游引物:5'-AGGGGTCTACATGGCAA CTG-3'。按Trizol說明書提取RNA，按照Primescript反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，然后按SYBR Green反應(yīng)條件進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，對反應(yīng)的退火溫度，引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳反應(yīng)體系和條件，用Bio-Rad RealtimePCR儀進(jìn)行檢測。每個樣本每次3個復(fù)孔，重復(fù)3次，反應(yīng)完成后機(jī)器自動得出各樣品的CT值，并且自動計算出基因相對表達(dá)量值。

1.3.2 免疫組織化學(xué)法檢測Wnt2蛋白的表達(dá):步驟:常規(guī)取材、脫水、石蠟包埋，制片;免疫組化法(SP法)，按試劑盒說明進(jìn)行操作，PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性片作為陽性對照。Wnt2以胞質(zhì)或胞核出現(xiàn)棕黃色或棕褐色為陽性信號。采用染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞百分率綜合評估。染色強(qiáng)度:無染色為0分;淡棕色為1分;棕色為2分;深棕色為3分。染色細(xì)胞百分率采取每張切片在200倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個高倍視野計數(shù):陽性細(xì)胞數(shù)＜25%為0分，25% ～50%為1分，51% ～70%為2分，＞70%為3分。評分標(biāo)準(zhǔn)將兩者積分相乘:0～1分為陰性(－)，2～3分為弱陽性(+)，4～6分為陽性(++)，7～9分為強(qiáng)陽性(+++)。

1.3.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和細(xì)胞分組:序列設(shè)計:靶基因siRNA序列以及陰性對照序列均己在基因Gene Bank數(shù)據(jù)庫中用BLAST檢索，確認(rèn)與靶細(xì)胞其他基因無同源性。Wnt2 siRNA序列為5'-GAAGATG GGAAGCGCCAAG-3'，陰性對照siRNA序列為5'-T TCTCCGAACGTGTCAGGT-3'。步驟:制備HepG2細(xì)胞懸液接種于12孔板，加入含有10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h再進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按LipofectamineTM2000說明書步驟分別進(jìn)行Wnt2-siRNA和陰性對照siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為4組:轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt2-siRNA的實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染陰性對照 siRNA的陰性對照組，加入 LipofectamineTM2000和培養(yǎng)液的脂質(zhì)體對照組，只加入培養(yǎng)液的空白對照組。

1.3.4 RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染后Wnt2 mRNA表達(dá):轉(zhuǎn)染24 h后，取1×106細(xì)胞 Trizol法提取總 RNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)方法同前。

1.3.5 Western blot檢測轉(zhuǎn)染后Wnt2蛋白表達(dá):轉(zhuǎn)染48 h后，提取細(xì)胞中的總蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳行蛋白分離，轉(zhuǎn)移到PVDF模上，小牛血清封閉后，加入一抗(工作濃度1∶600)，4 h，37 ℃搖床孵育過夜，洗膜3次，加入二抗(工作濃度1∶2 000)，2 h，37℃孵育過夜，洗膜3次，將 PVDF膜置于HRP-ECL化學(xué)發(fā)光試劑中反應(yīng)2 min。暗室中使X線片曝光，常規(guī)方法顯影定影。

1.3.6 MTT法檢測細(xì)胞增殖:取各組對數(shù)生長期的細(xì)胞，每孔1 000個接種于96孔培養(yǎng)板，每孔體積200 μL，每個樣品設(shè)3個復(fù)孔，將培養(yǎng)板置入培養(yǎng)箱中，在37℃、5%CO2、含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液條件下培養(yǎng)24 h。分別于接種后24、48和72 h用MTT法檢測。檢測時，吸取各孔中培養(yǎng)液，加入新RPMI 1640 培養(yǎng)液180 μL和20 μL MTT 溶液。繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜。用酶標(biāo)儀檢測570 nm波長下各孔的吸光度。

1.3.7 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期:取各組對數(shù)生長期的細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心，棄上清液，PBS重懸細(xì)胞，加入在－20℃預(yù)冷的75%乙醇固定，4℃固定12 h，離心，棄冰乙醇，PBS沖洗，棄上清液;加入含有PI(碘化吡啶)和RNA酶的PBS染色液，置4℃避光染色1 h。上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期時相分布，統(tǒng)計各期細(xì)胞相對百分比。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用單因素方差分析檢驗(yàn)組間差異的顯著性。計數(shù)資料以陽性率表示，采用卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 肝癌、癌旁和正常肝組織中Wnt2 mRNA的檢測

各樣本的擴(kuò)增曲線呈線性關(guān)系，溶解曲線呈單峰(圖1)。肝癌組，癌旁組和正常組Wnt2基因表達(dá)水平分別為 3.492±0.494、2.050±0.416和0.765±0.192(P ＜0.05)。

圖1 PCR擴(kuò)增曲線和溶解曲線Fig 1 Primary curve and solubility curve

圖2 各組中Wnt2蛋白的表達(dá)Fig 2 The expression of Wnt2 protein in groups(×200)

2.2 肝癌、癌旁和正常肝組織中Wnt2蛋白的檢測

Wnt2蛋白的陽性信號主要定位于胞質(zhì)和(或)胞核(圖2)。肝癌、癌旁和正常肝組織間差異有顯著性(P＜0.01)(表1)。

表1 Wnt2蛋白在各組中的表達(dá)Table 1 The expression of Wnt2 protein in groups

2.3 siRNA轉(zhuǎn)染后人肝癌HepG2細(xì)胞Wnt2 mRNA和蛋白的檢測

轉(zhuǎn)染后各組Wnt2基因及蛋白表達(dá)(表2，3，圖3)。實(shí)驗(yàn)組低于各對照組(P＜0.05)。

2.4 siRNA轉(zhuǎn)染后對人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響

在轉(zhuǎn)染24、48和72 h后檢測吸光度值。實(shí)驗(yàn)組與對照組相比均P＜0.05(表4)。

表2 熒光定量PCR檢測Wnt2在各組中的表達(dá)Table 2 The expression of Wnt2 in groups subjected to RT-qPCR(x ± s，n=3)

表3 Western blot檢測Wnt2在各組中的表達(dá)Table 3 The expression of Wnt2 protein in groups subjected to western blot(x ± s，n=3)

圖3 Western bolt檢測各組中Wnt2蛋白表達(dá)Fig 3 The expression of Wnt2 protein in groups used Western blot

表4 Wnt2-siRNA轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞對增殖活性的改變Table 4 The change of proliferation activity by Wnt2-siRNA transfection liver cancer cell(x ± s，A，n=3)

2.5 siRNA轉(zhuǎn)染后對人肝癌HepG2細(xì)胞周期的影響

轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，G1期細(xì)胞數(shù)明顯增多(P＜0.05)，S期細(xì)胞數(shù)明顯減少(P＜0.05)，G2期無明顯變化(表5)。

表5 Wnt2-siRNA轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞對細(xì)胞周期的影響Table 5 The influence of cell cycle by Wnt2-siRNA transfection liver cancer cell(±s，%，n=3)

表5 Wnt2-siRNA轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞對細(xì)胞周期的影響Table 5 The influence of cell cycle by Wnt2-siRNA transfection liver cancer cell(±s，%，n=3)

＊P ＜ 0.05 compared with control．

group cell cycle G0/G1 S G2/GM blank 38.6±3.7 43.2±2.5 18.2±2.0 negative control 40.4±1.2 41.2±2.7 18.0±1.5 liposome control 41.8±4.3 41.5±4.7 16.7±2.0 experimental 64.9±1.9* 19.9±1.3* 15.2±2.0*

3 討論

Wnt基因的發(fā)現(xiàn)已有 30年，早在 1982年Nusse［9］等人將鼠乳腺腫瘤病毒整合到小鼠宿主染色體上，激活了該位點(diǎn)的基因并在小鼠中引起了腫瘤的發(fā)生，他們將該位點(diǎn)的基因命名為int1，且認(rèn)為它是一種致癌基因。但后來的研究發(fā)現(xiàn)int1基因不僅出現(xiàn)在腫瘤中，在小鼠的胚胎發(fā)育中也起重要作用，與果蠅的胚胎發(fā)育基因wingless(wg)屬同源基因，wg基因突變導(dǎo)致果蠅無翅。因此將二者名字結(jié)合提出了Wnt基因的稱謂。Wnt基因在細(xì)胞正常的生長、發(fā)育、分化、凋亡中起作用，但是它也參與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，以及腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移等一系列生理病理過程［10］。

目前，關(guān)于Wnt通路與腫瘤關(guān)系的研究多數(shù)集中于Wnt信號系統(tǒng)成員 E-cadherin、β-catenin、APC和Axin等，Wnt基因本身表達(dá)異常與腫瘤之間關(guān)系的研究較多的也僅是Wnt1和Wnt5，Wnt2研究的報道較少。為此，本實(shí)驗(yàn)一開始在人肝癌中測出了Wnt2基因的高表達(dá)，再進(jìn)一步以Wnt2特異性siRNA轉(zhuǎn)染人肝癌HepG2細(xì)胞來觀察肝癌細(xì)胞的增殖生長情況。

本研究發(fā)現(xiàn)肝癌和癌旁中Wnt2 mRNA或蛋白都高于正常肝組織，且Wnt2特異性siRNA轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系HepG2后。實(shí)驗(yàn)組Wnt2基因表達(dá)低于各對照組，說明Wnt2 siRNA轉(zhuǎn)染后能有效抑制細(xì)胞相應(yīng)靶基因的表達(dá)。Western blot檢測各組Wnt2蛋白表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)其與Wnt2 mRNA的變化一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了siRNA轉(zhuǎn)染后不但能抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，也能抑制其蛋白的翻譯和表達(dá)。MTT法檢測顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖速度較對照組明顯降低，提示用siRNA使Wnt2基因沉默后，能抑制肝癌細(xì)胞的增殖;而對照組之間無明顯差別，從而排除了載體刺激因素導(dǎo)致細(xì)胞增殖力的改變。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的結(jié)果提示使用siRNA敲低肝癌細(xì)胞中Wnt2的表達(dá)后，G1期細(xì)胞數(shù)明顯增多，S期細(xì)胞數(shù)明顯減少，能夠有效抑制肝癌細(xì)胞的生長，并引起肝癌細(xì)胞生長周期的停滯。

綜上所述，Wnt2在肝癌中高表達(dá)，可以作為HCC診斷的一個重要新指標(biāo)。轉(zhuǎn)染靶向Wnt2的siRNA可有效敲低該基因在人肝癌細(xì)胞系HepG2內(nèi)的表達(dá)，且抑制了細(xì)胞的增殖能力。因此，對其進(jìn)一步研究可望提出肝癌治療的新策略。

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