晏 浩，李文林，徐建軍，朱書強，龍 翔，車建鵬

(南昌大學1.第二附屬醫(yī)院胸心外科;2.醫(yī)學院病理生理教研室，江西南昌330006)

癌基因DJ-1(CAP1/RS/PARK7)在腫瘤生物學中發(fā)揮極為重要的作用，它可保護腫瘤細胞應對缺氧誘導的細胞死亡和適應氧化應激［1］。DJ-1在人體各正常組織又廣泛表達，其通過在亞細胞水平的再分布發(fā)揮多重作用。常染色體隱性遺傳DJ-1突變可以導致早發(fā)型帕金森病，缺乏DJ-1類型的帕金森病患者對中風損傷更易感，而恢復DJ-1表達可以明顯減少氧化應激［2］。心肌缺血再灌注后往往同時出現(xiàn)壞死、凋亡和自噬［3］;其中，自噬是細胞長存蛋白和細胞器代謝的主要方式。缺血再灌注損傷不同階段自噬發(fā)揮不同作用，缺血階段AMPKa啟動低程度自噬被認為是應急供能的保護作用，而再灌注階段通過激活JNK導致過表達Beclin-1，過度自噬加重心肌損傷［4］。最近研究認為DJ-1參與自噬調(diào)控［5］，本研究通過以慢病毒為載體干擾心肌HL-1細胞DJ-1基因表達，探討其對缺氧復氧損傷中ROS影響對心肌自噬及預后的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

annexinⅤ-PI凋亡檢測試劑盒和活性氧檢測試劑盒 (南京凱基公司);monodansylcadaverin(MDC)和N-acetylcysteine(NAC)(Sigma-Aldrich美國);DJ-1shRNA慢病毒(sc-37081)、空對照慢病毒(sc-108080)和抗體 β-actin(Santa Cruz公司);抗體 Beclin-1(Cell Signaling公司)和 DJ-1、LC3(Abcam公司)及辣根過氧化物酶偶聯(lián)抗體(北京中杉公司);增強型化學發(fā)光顯色試劑盒(Thermo公司);蛋白提取試劑盒、蛋白酶磷酸酶復合抑制劑(普利萊公司);BCA蛋白定量(碧云天公司);其他試劑均為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞系培養(yǎng)和sh-DJ-1穩(wěn)定轉染細胞篩選:小鼠心肌HL-1細胞系來源于William Claycomb實驗室，采用DJ-1shRNA慢病毒和空對照慢病毒感染HL-1細胞，慢病毒以感染復數(shù)值為30孵育HL-1細胞轉染，感染后96 h傳代培養(yǎng);感染細胞再培養(yǎng)48 h后嘌呤霉素10 mg/L篩選，再常規(guī)培養(yǎng)待實驗。

1.2.2 缺氧復氧損傷模型的建立:穩(wěn)定表達篩選后HL-1細胞進行缺氧復氧培養(yǎng)，37℃預熱配置的缺氧液和復氧液，將培養(yǎng)的HL-1細胞換用的預充有95%N2+5%CO2的缺氧液，95%N2+5%CO2的密閉容器中培養(yǎng)2 h。再將缺氧的心肌細胞換用預充95%O2+5%CO2的含糖復氧液，并在95%O2+5%CO2的密閉容器中培養(yǎng)4 h，建立缺氧/復氧損傷模型。

1.2.3 實驗分組:根據(jù)實驗方案實驗分為5組:1)正常對照組(control):更換正常培養(yǎng)基后在CO2培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)6 h;2)單純?nèi)毖鯊脱踅M(H/R):更換缺氧液缺氧培養(yǎng)2 h，再更換復氧液復氧培養(yǎng)4 h;3)空慢病毒缺氧復氧組(H/R control virus):空慢病毒感染細胞更換缺氧液缺氧培養(yǎng)2 h，再更換復氧液復氧培養(yǎng)4 h;4)慢病毒shDJ-1缺氧復氧組(H/R shDJ-1 virus):慢病毒shDJ-1感染細胞更換缺氧液缺氧培養(yǎng)2 h，再更換復氧液復氧培養(yǎng)4 h;5)慢病毒shDJ-1缺氧復氧 +NAC(H/R shDJ-1 virus plus NAC)組:慢病毒shDJ-1感染細胞更換缺氧液(含5 mmol/L NAC)缺氧培養(yǎng)2 h，再更換復氧液(含5 mmol/L NAC)復氧培養(yǎng)4 h。

1.2.4 細胞蛋白制備和Western blot檢測細胞蛋白表達水平:按照細胞總蛋白提取試劑盒說明書提取蛋白，并按BCA法蛋白定量檢查蛋白濃度，采用聚丙烯酰氨凝膠電泳，轉至PVDF膜2 h，Beclin-1和DJ-1以 β-actin為內(nèi)參蛋白，LC3蛋白轉化以LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值參考，膠片曝光，通過ImageJ圖像軟件分析統(tǒng)計。

1.2.5 流式細胞儀檢測各組HL-1細胞內(nèi)ROS、自噬溶酶體和死亡情況:細胞死亡檢測參照AnnexinⅤ-PI細胞凋亡試劑盒說明書，通過流式細胞儀(BD)激發(fā)波長488 nm，AnnexinⅤ熒光信號呈綠色，表示早期凋亡細胞，PI熒光信號呈紅色，表示晚期凋亡細胞和其他膜完整破壞的死亡細胞;MDC染色檢測細胞內(nèi)的自噬體，收集各組HL-1細胞洗滌后加入50 μmol/L MDC避光孵育10 min，洗滌后通過流式細胞儀激發(fā)波長340 nm，而DCFH-DA染色檢測細胞內(nèi)的自噬體，收集各組HL-1細胞洗滌后加入10 μmol/L DCFH-DA 避光孵育20 min，洗滌后通過流式細胞儀(BD)激發(fā)波長488 nm。所有數(shù)據(jù)通過CellQuest軟件分析統(tǒng)計。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件，所有實驗重復3～5次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準(±s)表示，使用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間有顯著差異者用Tukey's-t檢驗進行兩兩比較。

2 結果

2.1 DJ-1shRNA慢病毒對HL-1細胞DJ-1蛋白的沉默效率

相比正常對照和空慢病毒感染細胞，慢病毒shDJ-1感染細胞均顯著下調(diào)DJ-1蛋白(圖1)。

2.1 各組HL-1細胞內(nèi)ROS水平變化

相比正常組，單純?nèi)毖鯊脱踅M顯著上調(diào)HL-1細胞內(nèi)ROS，而H/R shDJ-1 virus組加劇缺氧復氧導致ROS水平上調(diào)。使用自由基清除劑NAC可以有效減少HL-1細胞內(nèi)ROS水平(圖2)。

圖1 慢病毒感染HL-1細胞DJ-1蛋白表達變化Fig 1 Expression change of DJ-1 after lentivirus transfection

2.3 各組HL-1細胞內(nèi)自噬體數(shù)量和Beclin-1、LC3蛋白轉化的變化

相比空病毒感染缺氧復氧組，慢病毒shDJ-1缺氧復氧組和慢病毒shDJ-1缺氧復氧+NAC組均減少DJ-1表達(圖4);空病毒感染缺氧復氧組相比正常對照組增加LC3-Ⅰ轉化為LC3-Ⅱ;而相比單純?nèi)毖鯊脱踅M和空病毒感染缺氧復氧組，H/R shDJ-1 virus組顯著增加LC3-Ⅰ轉化為LC3-Ⅱ，而NAC可以有效減少LC3-Ⅰ轉化為LC3-Ⅱ(圖5)。對于自噬主要蛋白Beclin-1，相比空病毒感染缺氧復氧組，H/R shDJ-1 virus組顯著上調(diào)Beclin-1，而NAC可以有效減少Beclin-1上調(diào)(圖4)。

相比正常對照組，單純?nèi)毖鯊脱踅M顯著增加自噬體數(shù)量，而且H/R shDJ-1 virus組自噬體數(shù)量顯著多于空病毒感染缺氧復氧組和單純?nèi)毖鯊脱踅M，但添加NAC并未顯著減少自噬體數(shù)量(圖3)。

2.4 各組HL-1細胞死亡情況

由于缺氧復氧時間較短，各組間PI染色的細胞死亡無明顯差異;而在AnnexinⅤ染色中，而相比單純?nèi)毖鯊脱踅M和空病毒感染缺氧復氧組，H/R shDJ-1 virus組顯著增加早期凋亡;而添加NAC可以顯著減少DJ-1敲除導致的早期凋亡(圖6)。

圖2 慢病毒感染HL-1細胞缺氧復氧后ROS水平變化Fig 2 Change of ROS level after lentivirus transfection and hypoxia/reoxygenation

3 討論

DJ-1是位于人染色體1p36.23位點的高度保守蛋白，一般認為DJ-1在細胞缺氧、氧化應激和分子伴侶等方面發(fā)揮重要作用。該研究采用心肌HL-1細胞缺氧復氧模型，觀察到敲除DJ-1后可增加HL-1細胞內(nèi)自噬體、上調(diào)Beclin-1和增加LC3-Ⅰ轉化為LC3-Ⅱ的自噬標志過程，同時增加缺氧復氧HL-1細胞的死亡，而氧自由基清除劑NAC可以消除這些作用。

圖5 慢病毒感染HL-1細胞缺氧復氧后LC3-Ⅰ轉化LC3-Ⅱ程度變化Fig 5 Conversion of LC3-Ⅰ to LC3-Ⅱ after lentivirus transfection and hypoxia/reoxygenation

DJ-1被認為具有抗氧自由基的作用，在生理條件下DJ-1維持線粒體生理活性和減少氧自由基生成［6］，在短期氧化應激就促進大量DJ-1被轉運至線粒體，并在外膜形成二聚體直接抵抗氧化應激對細胞的損傷［7］。長時間應激時DJ-1進一步聚集到細胞核，DJ-1通過穩(wěn)定抗氧化核轉錄因子Nrf2的結構，促進Nrf2調(diào)控的谷胱苷肽、谷氨酰半胱氨酸合成酶等抗氧化物質(zhì)轉錄，減少氧化應激損傷［8－9］。

圖6 慢病毒感染HL-1細胞缺氧復氧后細胞死亡情況Fig 6 Cell death after lentivirus transfection and hypoxia/reoxygenation

自噬是哺乳動物細胞大分子物質(zhì)和細胞器的循環(huán)代謝的主要降解途徑，氧化應激也被認為也是誘導自噬的主要因素［10］，該研究發(fā)現(xiàn)DJ-1敲除明顯上調(diào)ROS，而ROS水平增加可以明顯上調(diào)Beclin-1表達，這與腫瘤細胞中通過JNK信號途徑介導自噬相一致［11］。應激條件下，自噬的作用一直有爭議，在心肌缺血再灌注損傷中，缺血期輕度自噬被認為有保護作用［12］，而在灌注期激活過度Beclin-1介導自噬被認為會加重心肌損傷;而且凋亡和自噬之間關系密切，凋亡啟動過程中激活的caspase可以剪切Beclin-1，剪切后形成的C端Beclin-1可以結合線粒體，并促進線粒體細胞色素C釋放，導致細胞凋亡［13］。所以，推測在缺氧復氧模型中敲除DJ-1增加凋亡的機制可能也包括Beclin-1介導有害自噬而促進凋亡。

由于在神經(jīng)元DJ-1、PINK1和Parkin對于大分子物質(zhì)形成復合體介導異常折疊蛋白的降解過程;對于細胞器，例如線粒體，DJ-1也參與PINK1/Parkin介導的線粒體自噬［14］。而在心肌HL-1細胞敲除DJ-1并未明顯影響自噬降解過程，有文獻報道DJ-1與PINK1及Parkin的作用是平行互補的，所以可能DJ-1自噬介導作用可能被PINK1及Parkin所替代［15］。

DJ-1參與心肌缺血保護的機制頗為復雜，迄今尚未完全清楚，但抗氧化應激被認為是其主要機制，對DJ-1深入研究將為缺血心肌病的診療提供新的靶點。

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