梅佳軍，張常青，劉嶸明，馬江鋒，陳可泉，姜 岷

（南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，材料化學工程國家重點實驗室，江蘇 南京 211816）

琥珀酸又名丁二酸，是三羧酸循環(huán)的中間代謝產物，也是厭氧碳代謝過程的還原性終端產物。琥珀酸作為一種四碳二元羧酸，廣泛應用于食品、農業(yè)、制造業(yè)等各個領域[1]。利用細菌、真菌等各種微生物合成琥珀酸的生物法，原料來源廣泛，污染小，反應溫和，成為近年來研究的熱點[2-3]。

目前，以棉纖維材料為吸附載體的固定化方法已經廣泛用于有機酸[4-6]、酶制劑[7-8]、還原膠[9]等化學品的生產。棉纖維載體廉價易得，生物、化學及熱力學穩(wěn)定，相較于其它無機吸附材料如陶粒、木屑、秸稈等擁有更大的比表面積和孔隙率，傳質效率更高[10-12]。通過對吸附材料的表面預處理，載體能提高吸附特異性，更多活力高的細胞富集到載體上，預處理后的載體吸附穩(wěn)定性更高，更適合長期的固定化發(fā)酵[13-14]。聚乙烯亞胺（polyethyleneimine,PEI）是一種強堿性的高分子聚合物，聚合物分子鏈中含有多個陽離子基團，具有較高的電荷密度，能與纖維素中的的羥基反應并交聯(lián)聚合，常被用于對細胞或載體的表面改性[15-16]。戊二醛（glutaraldehyde, GA）常用來做交聯(lián)劑，戊二醛中的醛基可以交聯(lián)聚乙烯亞胺中的氨基，經常用于酶的固定化研究，同時能與微生物細胞膜的磷脂雙分子層中的蛋白質相互作用。眾多實驗表明用聚乙烯亞胺和戊二醛化學處理后的棉纖維載體，表面正電荷量、表面粗糙度、攜帶的活性基團數(shù)等[17-18]均有所提高，增加了載體細胞負載量和吸附強度。

本工作用聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）和戊二醛（glutaraldehyde, GA）對棉纖維載體進行預處理，提高載體對菌體的吸附作用，考察其對丁二酸生產菌株Escherichia coliAFP111 [F+ λrpoS396(Am)rph-1△(pflAB::Cam)ldhA::Kan 95ptsG]細胞固定效率及發(fā)酵性能的影響，在此基礎上，對改性材料固載的細胞進行7次重復批式發(fā)酵，探討了材料吸附和固定化發(fā)酵的穩(wěn)定性，為下一步研究和放大培養(yǎng)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基

菌 種 ：Escherichia coliAFP111 [F+λrpoS396(Am)rph-1△(pflAB::Cam)ldhA::Kan 95ptsG]，由 David P.Clark 教授（Southern Illinois University）惠贈。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g/L，酵母浸粉 5 g/L，NaCl 5 g/L，pH值7.0，卡那霉素30 mg/L，氯霉素30 mg/L，過濾除菌后加入。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g/L，酵母浸粉5 g/L，NaCl 5 g/L，pH值7.0，葡萄糖43 g/L，堿式碳酸鎂33.6 g/L。其中，研究“不同PEI-GA改性棉纖維添加量對固定化批次發(fā)酵丁二酸的影響”時葡萄糖濃度為21 g/L，“不同初始葡萄糖濃度對固定化批次發(fā)酵丁二酸的影響”時，葡萄糖濃度分別選擇 19 g/L、30 g/L、39 g/L、47 g/L、59 g/L，相應堿式碳酸鎂和糖的比例按4∶5添加，卡那霉素30 mg/L，氯霉素30 mg/L。

1.2 材 料

載體的原材料為市售純白棉布（厚 1 mm，孔隙率＞95%，密度 0.25 g/cm，比表面積＞40 m2/m3），裁剪為1 cm×1 cm，純水洗凈烘干備用。

1.3 方 法

1.3.1 棉纖維的預處理

使用PEI修飾上述洗凈烘干后的棉纖維載體，放置于2 g/L的 PEI 水溶液中浸泡 2 h，用 HCl 調整溶液 pH值至 7.0，在去離子水中充分漂洗，烘干，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

再使用 GA交聯(lián)處理經 PEI 化學修飾的棉纖維織物，在含GA 10 g/L 的 0.05 mol/L 磷酸鉀緩沖溶液中（pH 值7.0）浸泡 2 h，在去離子水中充分漂洗，烘干，4 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 靜態(tài)吸附試驗

收集處于穩(wěn)定生長時期的菌體細胞，離心（12000 r/min，10 min，4 ℃），用 0.5 mol/L 磷酸鉀緩沖溶液（pH值 7.0）洗滌兩次，再次懸浮于上述磷酸鉀緩沖溶液中，初始OD600值為6.19。裁成小方塊的棉纖維織物按100 g/L放入含50 mL菌懸液的厭氧血清瓶內，置于搖床中，轉速控制在 150 r/min，溫度為 37 ℃。菌體吸附4 h，直至菌懸液中的OD600值不再降低。

1.3.3 種子培養(yǎng)

將保存于－80 ℃凍存管中的菌株以1%的接種量轉接到裝液量為5 mL的試管中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h作為一級種子。將試管中的一級種子，以1%的接種量轉接到裝液量為100 mL 的500 mL 三角瓶中，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)6 h，作為二級種子。

1.3.4 搖瓶發(fā)酵

將二級種子液以10%的接種量轉接到裝液量為50 mL的厭氧血清瓶中，通無菌CO22 min以維持厭氧環(huán)境，37℃、200 r/min 培養(yǎng)。固定化細胞的重復批式發(fā)酵是指在培養(yǎng)基中加入無機載體，當發(fā)酵結束后，去掉發(fā)酵液，然后加入新鮮的培養(yǎng)液再次進行發(fā)酵，其培養(yǎng)基組成同前所述。

1.3.5 分析檢測

菌體密度測定：紫外可見分光光度、（Spectrumlab 752 S），于600 nm處測定吸光值。

葡萄糖濃度測定：生物傳感分析儀（SBA240C，山東省科學院生物研究所）。

發(fā)酵液中有機酸的測定：用高效液相色譜法（HPLC）檢測，色譜柱為Prevail Organic Acid，流動相為25 mmol/L KH2PO4，pH值 2.5，流速1.0 mL/min，紫外檢測波長215 nm，丁二酸出峰時間為9.9 min, 乙酸出峰時間為6.2 min。

靜態(tài)細胞吸附效率計算方法：

式中，A1為吸附開始時游離細胞濃度，以該濃度下的吸光度OD600表示；A2為吸附結束時游離細胞濃度，以該濃度下吸光度OD600表示；η為細胞吸附效率。

2 結果與討論

2.1 材料預處理對靜態(tài)吸附效果的影響

天然的纖維質材料由于和微生物細胞的表面特性相近，一定程度上阻礙了菌體細胞的吸附過程。因此，采用PEI和GA對棉纖維織物進行化學修飾。本實驗探討了化學改性前后載體靜態(tài)吸附情況，結果如圖1所示。

圖1 材料預處理對靜態(tài)吸附效果的影響

圖1結果表明，4 h后未處理和改性過的棉纖維載體細胞吸附率分別為 53.3%和 87.1%，預處理后載體負載量提高了 63.3%，證明該預處理方法能有效提高了載體的吸附性能。

2.2 初始葡萄糖濃度對固定化批次發(fā)酵丁二酸的影響

PEI-GA棉纖維載體的添加量為100 g/L，培養(yǎng)基中分別添加19g/L、30g/L、39g/L、47g/L、59 g/L的葡萄糖，厭氧發(fā)酵結束，測定丁二酸、乙酸產量和生物量，結果見圖2。

由圖2可見，隨著葡萄糖濃度的提高，丁二酸的終濃度也增加，但轉化率下降，游離細胞濃度也隨之升高，高濃度的葡萄糖不利于細胞的吸附。當葡萄糖的濃度高于47 g/L，丁二酸產量不再增加，且轉化率下降明顯，乙酸量明顯增加，發(fā)酵體系中游離細胞占多數(shù)。因此，控制發(fā)酵初始葡萄糖的濃度低于47 g/L有利于細胞的固定化發(fā)酵。

圖2 初始葡萄糖濃度對固定化批次發(fā)酵丁二酸的影響（丁二酸收率=生成丁二酸的質量/消耗底物葡萄糖的質量）

2.3 PEI-GA改性棉纖維添加量對固定化批次發(fā)酵丁二酸的影響

將PEI-GA棉纖維按照80～180 g/L的添加量加入發(fā)酵培養(yǎng)基，厭氧發(fā)酵48 h，結果見圖3。

由圖3可見，當PEI-GA棉纖維添加量從80 g/L增加到120 g/L，游離細胞濃度由OD600從2.0降至1.6，丁二酸產量由12.72 g/L增至14.78 g/L，轉化率從60.6%提高到70.3%，隨著載體添加量的繼續(xù)增加，雖然游離細胞量繼續(xù)下降，但丁二酸產量明顯下降且乙酸量增加，原因在于反應體積有限，而載體加入量過多，導致傳質效果不好，影響丁二酸產量，因此確定PEI-GA棉纖維最佳添加量為120g/L。

2.4 PEI-GA棉纖維與未改性載體固定化批次發(fā)酵的對比

根據(jù)上述優(yōu)化過的條件，進行改性前后發(fā)酵對比實驗，載體添加量為120 g/L,初糖濃度控制在43 g/L,厭氧發(fā)酵結束，測定丁二酸產量、乙酸產量、丁二酸轉化率和生物量，結果見表1。

圖3 不同PEI-GA改性棉纖維添加量對固定化批次發(fā)酵丁二酸的影響

表1 PEI-GA棉纖維與未改性載體固定化批次發(fā)酵的對比

由表1可見，發(fā)酵終止時，與添加未處理載體相比，PEI-GA棉纖維載體發(fā)酵液中游離細胞濃度OD600由3.5降至1.8，丁二酸產量提高了11.3%，乙酸產量降低了29.8%，丁二酸轉化率提高了7.5%?？梢娸d體改性對菌的生產性能有一定程度的提高，有利于固定化大腸桿菌生產丁二酸。

2.5 PEI-GA棉纖維固定化重復化批次發(fā)酵產丁二酸

通過重復批次發(fā)酵實驗來驗證改性載體在固定化發(fā)酵產丁二酸中的重復穩(wěn)定性，載體添加量為120 g/L，初糖濃度控制在43 g/L左右，對固定化大腸桿菌進行了重復 7批次發(fā)酵實驗，每批次發(fā)酵結束，記錄所產丁二酸、乙酸、游離細胞濃度，生產速率和轉化率，結果如圖4 、圖5所示。

由圖4、圖5可知，7批重復固定化發(fā)酵丁二酸產量穩(wěn)定維持在 27.4 g/L以上并且沒有下降趨勢，前3批發(fā)酵完成后，大腸桿菌在固定化材料上生長達到平衡，生產效率和轉化率分別維持在0.657 g/(L·h) 和 70.42%以上，乙酸產量和游離細胞濃度略有下降。綜上所述，在重復分批次發(fā)酵實驗中，丁二酸產量、生產效率和轉化率在經過7批發(fā)酵后仍保持較高水平，吸附于改性載體上的菌體活力無明顯下降，載體上一直保持較高的活細胞比例[19-21]，載體有較好重復穩(wěn)定性。

圖4 PEI-GA棉纖維固定化重復化批次發(fā)酵產丁二酸

圖5 不同批次生產效率和轉化率

2.6 發(fā)酵前后材料掃描電鏡觀察

利用 SEM 對材料改性前后的表面和發(fā)酵結束后固定化細胞形態(tài)進行分析，結果如圖6。

從掃描電鏡圖6（a）、（b）中發(fā)現(xiàn)，未處理棉纖維織物表面相對光滑，而經過PEI-GA處理后，纖維表面連接上了很多聚乙烯亞胺多聚體，褶皺增多，表面粗糙度提高，增加與菌體的接觸面積，從而增加載體的負載量[22-23]。圖 6（c）為未處理載體固定化發(fā)酵結束菌體在載體上的固定形態(tài)，菌體分布稀疏，固定于載體的細胞較少，而圖 6（d）中在連接有聚乙烯亞胺多聚體的部位富集有大量菌體，該現(xiàn)象符合2.4節(jié)中測得的發(fā)酵體系最終游離細胞濃度結果。

圖6 改性前后載體和發(fā)酵結束固定化細胞掃描電鏡圖

3 結 論

本工作考察了用聚乙烯亞胺（PEI）和戊二醛（GA）改性前后載體靜態(tài)吸附情況，經過化學改性后，棉纖維載體的負載量得到顯著提高，表明 PEI和GA改性對提高載體與細胞之間的相互作用是一種行之有效的方法。

由于真實發(fā)酵環(huán)境比較復雜，培養(yǎng)基組成對細胞吸附行為有很大的影響，本文重點考察了初始葡萄糖濃度對固定化發(fā)酵產丁二酸的影響。結果表明隨著葡萄糖初始濃度的增加，發(fā)酵體系中游離細胞濃度也隨之增加，與Bar等[24]的報道一致，丁二酸的轉化率降低，乙酸的產率增加，產物分布的改變，原因可能是代謝途徑中的關鍵酶受到抑制使代謝途徑改變生成其它物質[25-26]，比如乙酸。改性載體添加量增加有利于細胞的吸附，但是發(fā)酵體系有限，添加過多的載體反而不利于傳質，導致丁二酸轉化率下降，副產物增多。

在重復批次固定化發(fā)酵過程中，第三批之后，隨著菌體生長達到平衡，丁二酸產量、產率等均有小幅上升，原因可能是吸附于載體上的菌體與載體之間不再只有單純的物理吸附，已經發(fā)生生物吸附，從電鏡圖可以直觀地看出，改性載體表面連接有聚乙烯亞胺多聚體的部位聚集有大量菌體，形成菌膜，菌體局部密度更大，更能適應發(fā)酵體系。重復7批次的過程中，丁二酸的最終濃度、生產效率和轉化率無下降趨勢，體現(xiàn)了棉纖維織物等纖維材料作為載體的優(yōu)點，固定化細胞可以不斷更新，固定化載體上一直保持較高的活細胞比例。

本工作主要考察了以PEI和GA化學修飾棉纖維為載體的丁二酸固定化發(fā)酵，與改性載體固定化發(fā)酵相比，丁二酸產量、生產效率和轉化率均有所提高。7批次重復發(fā)酵過程中，生產效率無下降趨勢，有較好的重復穩(wěn)定性。

[1]Willke T, Vorlop K D.Industrial bioconversion of renewable resources as an alternative to conventional chemistry[J].Appl.Microbiol.Biotechnol., 2002, 66（2）：131-142.

[2]Cukalovic A, Stevens C V.Feasibility of production methods for succinic acid derivatives：A marriage of renewable resources and chemical technology[J].Biofuels Bioprod.Bioref., 2008, 2（6）：505–529.

[3]Song H, Lee S Y.Production of succinic acid by bacterial fermentation[J].Enzyme Microb.Technol., 2006, 39（3）：352–361.

[4]Zhang A, Yang S T.EngineeringPropionibacterium acidipropionicifor enhanced propionic acid tolerance and fermentation[J].Biotechnol.Bioeng., 2009, 104（4）：766-773.

[5]Tay A, Yang S T.Production of L （+）-lactic acid from glucose and starch by immobilized cells ofRhizopus oryzaein a rotating fibrous bed bioreactor[J].Biotechnol.Bioeng., 2002, 80（1）：1-12.

[6]Suwannakham S, Yang S T.Enhanced propionic acid fermentation byPropionibacterium acidipropionicimutant obtained by adaptation in a fibrous-bed bioreactor [J].Biotechnol.Bioeng., 2005, 91（3）：325-337.

[7]Bai Y, Yang S T.Biotransformation of R-2-hydroxy-4-phenylbutyric acid by D-lactate dehydrogenase andCandida boidiniicells containing formate dehydrogenase coimmobilized in a fibrous bed bioreactor [J].Biotechnol.Bioeng., 2005, 92（2）：137-146.

[8]Kilonzo P, Margaritis A, Bergougnou M.Airlift-driven fibrous-bed bioreactor for continuous production of glucoamylase using immobilized recombinant yeast cells[J].J.Biotechnol., 2009, 143（1）：60-68.

[9]Yang S T, Lo Y M, Min D B.Xanthan gum fermentation byXanthomonas campestrisimmobilized in a novel centrifugal fibrous-bed bioreactor[J].Biotechnol.Prog., 1998, 12（5）：630-637.

[10]Chu Y F, Hsu C H, Soma P K, et al.Immobilization of bioluminescentEscherichia colicells using natural and artif i cial fi bers treated with polyethylenimine [J].Bioresour.Technol., 2009,100（13）：3167-3174.

[11]Huang Y, Yang S T.Acetate production from whey lactose using co-immobilized cells of homolactic and homoacetic bacteria in a fi brous-bed bioreactor[J].Biotechnol.Bioeng., 1998, 60（4）：498-507.

[12]Melo J S, D’Souza S F.Simultaneous fi ltration and immobilization of cells from a fl owing suspension using a bioreactor containing polyethylenimine coated cotton threads：Application in the continuous inversion of concentrated sucrose syrups [J].World J.Microbiol.Biotechnol.,1999,15（1）：23-27.

[13]Kim D N, Park J, Koh W G.Control of cell adhesion on poly（ethyleneglycol）hydrogel surface using photochemical modif i cation and micropatterning technique[J].J.Ind.Eng.Chem.,2009,15（1）：124-128.

[14]Kawaguti H Y, Buzzano M F, Orsi D C ,et al.Effect of the additive polyethylenimine and glutaraldehyde on the immobilization ofErwiniasp.D12 cells in calcium alginate for isomaltulose production[J].Process Biochem., 2006 , 41（9）：2035-2040.

[15]Kamath N, D-Souza S F.Immobilization of ureolytic cells through flocculation and adhesion on cotton cloth using polyethylenimine [J].Enzyme Microb.Technol., 1991,13（11）：935-938.

[16]Liu X M, Sheng G P, Wang J, et al.Quantifying the surface characteristics and flocculability ofRalstonia eutropha[J].Appl.Microbiol.Biotechnol., 2008, 79（2）：187-194.

[17]Rochex A, Lecouturier D, Pezron I, et al.Adhesion of aPseudomonas putidastrain isolated from a paper machine to cellulose fibres [J].Appl.Microbiol.Biotechnol., 2004, 65（6）：727-733.

[18]Briandet R, Meylheuc T, Maher C, et al.Listeria monocytogenesScott A：Cell surface charge, hydrophobicity, and electron donor and acceptor characteristics under different environmental growth conditions [J].Appl.Environ.Microbiol., 1999, 65（12）：5328-5333.

[19]Liu X, Chung Y K, Yang S T, et al.Continuous nisin production in laboratory media and whey permeate by immobilized Lactococcus lactis [J].Process Biochem., 2005, 40（1）：13-24.

[20]Shen G J, Annous B A, Lovitt R W, et al.Biochemical route and control of butyrate synthesis inButyribacterium methylotrophicum[J].Appl.Microbiol.Biotechnol., 1996, 45（3）：355-362.

[21]Zhu H, Yang S T.Long-term continuous production of monoclonal antibody by hybridoma cells immobilized in a fibrous-bed bioreactor[J].Cytotechnology, 2004, 44（1）：1-14.

[22]Hsu C H, Chu Y F, Argin‐Soysal S, et al.Effect of surface characteristics and xanthan polymers on the immobilization ofXanthomonas campestristo fi brous matrices[J].J.Food.Sci., 2004 ,69（9）：E441-E448.

[23]Huang Y, Yang S T.Acetate production from whey lactose using co-immobilized cells of homolactic and homoacetic bacteria in a fi brous-bed bioreactor[J].Biotechnol.Bioeng., 1998 , 60（4）：498-507.

[24]Bar R, Gainer J L, Kirwan D J.Ethanol fermentation by ionically adsorbedZymomonas mobilis：Environmental effects on cell immobilization[J].Biotechnol.Bioeng., 1987,29（9）：1045-1049.

[25]Gourdon P, Lindley N D.Metabolic analysis of glutamate production byCorynebacterium glutamicum[J].Metab.Eng., 1999, 1（3）：224-231.

[26]Hasegawa T, Hashimoto K I, Kawasaki H, et al.Changes in enzyme activities at the pyruvate node in glutamate-overproducingCorynebacterium glutamicum[J].J.Biosci.Bioeng., 2008, 105（1）：12-19.