夏子義，倪 曄，孫志浩，王 云，吳香玉

（江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

近年來，隨著原油價格的不斷上漲和石化燃料生產(chǎn)和使用中所引起的環(huán)境問題的加劇，發(fā)酵法生產(chǎn)新型生物燃料得到了廣泛關(guān)注[1]。丁醇作為一種四碳平臺化合物，被廣泛用作溶劑和有機(jī)合成化學(xué)工業(yè)的原料。另外，與傳統(tǒng)的生物燃料乙醇相比，丁醇具有與汽油相當(dāng)?shù)臒嶂岛托镣橹怠⑤^低的腐蝕性和揮發(fā)性、能與汽油以任意比混合等優(yōu)點(diǎn)[2]。因此，丁醇被認(rèn)為是一種極具潛力的新型生物燃料。

丁醇可以通過化學(xué)合成和厭氧發(fā)酵兩種方式生產(chǎn)。發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇可以追溯到第一次世界大戰(zhàn)期間，采用的操作方式多為分批發(fā)酵，其規(guī)模曾僅次于燃料乙醇發(fā)酵[3]。到20世紀(jì)中期，由于廉價的石化法的出現(xiàn)，發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇逐漸被淘汰[4]，但是我國、前蘇聯(lián)等國家仍繼續(xù)采用發(fā)酵法，并進(jìn)行工藝改進(jìn)使用連續(xù)發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇[5]。傳統(tǒng)的分批發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮丁醇存在產(chǎn)物對菌體有毒害、溶劑總濃度低、生產(chǎn)率和得率低等缺點(diǎn)[6]，其生產(chǎn)率僅有0.1～0.3 g/(L·h)[7]。另外，丁醇本身的毒性也會降低其生產(chǎn)率。這些問題能通過菌種改造[8-9]或者使用連續(xù)發(fā)酵與下游產(chǎn)物提取技術(shù)相結(jié)合[10]的操作方法來解決。連續(xù)發(fā)酵通過不斷地補(bǔ)加新鮮的培養(yǎng)基同時排出等量的發(fā)酵醪液來使菌體處于穩(wěn)定的生長狀態(tài)，與其它的發(fā)酵方式相比可以縮短發(fā)酵周期提高設(shè)備利用率，降低溶劑對菌體的毒害作用，提高溶劑的生產(chǎn)率[11]。2006年Liew等[12]以西米淀粉為原料進(jìn)行單級連續(xù)發(fā)酵產(chǎn)丁醇的研究表明在稀釋率為0.1 h?1和pH值控制在4.5的條件下可以獲得0.85 g/(L·h)的生產(chǎn)率，為分批發(fā)酵的1.5倍。2011年Malaviya等[13]采用化學(xué)誘變得到菌株Clostridium pasteurianumMBEL_GLY2，以甘油為主要的碳源進(jìn)行細(xì)胞循環(huán)連續(xù)發(fā)酵，稀釋率0.9 h?1時丁醇和總?cè)軇┑纳a(chǎn)率分別為 8.3 g/(L·h)和7.8 g/(L·h)。2011 年 Richter 等[14]以Clostridium saccharoperbutylacetonicumN1-4為發(fā)酵菌種，丁酸和葡萄糖為底物，采用耦合氣提兩級連續(xù)發(fā)酵的操作方式，在0.025 h?1的稀釋率下獲得了15.7 g/L的總?cè)軇?，丁醇的生產(chǎn)率為0.39 g/(L·h)。

本研究以Clostridium saccharobutylicumDSM 13864為發(fā)酵菌株，葡萄糖為碳源進(jìn)行四級連續(xù)發(fā)酵，考察了稀釋率和溫度對丁醇生產(chǎn)的影響。通過以葡萄糖培養(yǎng)基進(jìn)行四級連續(xù)發(fā)酵的研究，旨在提高溶劑的生產(chǎn)率和獲得一種能長時間穩(wěn)定操作的連續(xù)發(fā)酵模式，為使用廉價糖質(zhì)原料（如糖蜜、秸稈水解液等）進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)丙酮丁醇的工業(yè)化提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

Clostridium saccharobutylicumDSM 13864 購自德國微生物菌種保藏中心（DSMZ）。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基（RCM培養(yǎng)基）：酵母膏3 g/L，牛肉膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，可溶性淀粉1 g/L，葡萄糖5 g/L，半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L，NaCl 3 g/L，NaAc 3 g/L，刃天青 3 mg/L，pH 值6.5，115 ℃ 滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 60 g/L，玉米漿干粉 10 g/L，CaCO34.0 g/L，(NH4)2SO42 g/L，K2HPO40.5 g/L，MnSO4·H2O 0.01 g/L，pH 值 6.0，115 ℃ 滅菌20 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

種子培養(yǎng)：室溫保藏的菌種孢子懸液以10%的接種量轉(zhuǎn)接于RCM培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)12～18 h。

分批發(fā)酵：將種子液按8%的接種量，接種到3 L發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量1.5 L，37 ℃條件下發(fā)酵66 h。

連續(xù)發(fā)酵：連續(xù)發(fā)酵在3 L發(fā)酵罐中進(jìn)行，采用四級連續(xù)發(fā)酵，每級罐的工作體積維持在1 L，4個罐分別命名為一級罐（Ⅰ）、二級罐（Ⅱ）、三級罐（Ⅲ）和四級罐（Ⅳ）。連續(xù)發(fā)酵前，一級和二級罐裝有 1L發(fā)酵培養(yǎng)基，三級和四級為空罐，在一級和二級接種并進(jìn)行16～18 h的分批發(fā)酵后，開始以一定的速率向一級罐中補(bǔ)加新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基，同時二級罐中的發(fā)酵液以相同的速率流入到三級罐中，待三級罐積累到1 L后開始流入四級罐，各級罐的發(fā)酵體積通過蠕動泵控制在1 L?？疾煜♂屄剩―）對連續(xù)發(fā)酵的影響時，4個罐的溫度都控制在37 ℃，轉(zhuǎn)速為50 r/min，稀釋率分別為0.03 h?1、0.05 h?1和0.1 h?1?？疾鞙囟葘B續(xù)發(fā)酵的影響時，稀釋率為0.05 h?1，轉(zhuǎn)速為50 r/min，一級和二級罐維持恒溫 37 ℃，三級和四級罐的溫度相同，分別控制在30 ℃、33 ℃和37 ℃。整個連續(xù)發(fā)酵過程中無pH值的調(diào)控，每隔一定時間取樣分析。

1.4 測定方法

菌體濃度：發(fā)酵液用1.8%的稀鹽酸稀釋一定倍數(shù)后，在600 nm處測定其吸光值，然后代入菌體濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1.076x－0.001（R2=0.999），x為OD600，y為菌體濃度。

糖含量：葡萄糖濃度使用SBA-40C生物傳感分析儀（山東省科學(xué)院生物研究所）測定。

相關(guān)參數(shù)的計(jì)算方法：得率=總?cè)軇?總糖消耗；生產(chǎn)率=總?cè)軇?總停留時間；停留時間=1/稀釋率。

溶劑和有機(jī)酸：溶劑（丙酮、乙醇、丁醇）和有機(jī)酸（乙酸、丁酸）的測定采用氣相色譜法（GC）。毛細(xì)管色譜柱：PEG-20M（30 m×0.32 mm×0.5μm）。柱溫條件：初始60 ℃，保持0.5 min后，以10 ℃/min的速度升至120 ℃，保持0.5 min后，以15 ℃/min的速度升至150 ℃，保持0.5 min后，以20 ℃/min的速度升至190 ℃，保持1 min。進(jìn)樣口溫度180 ℃，F(xiàn)ID檢測器溫度210 ℃，進(jìn)樣量1.0 μL，分流比90∶1。尾吹流速29 mL/min，氫氣流速30 mL/min，空氣流速300 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 L發(fā)酵罐中的分批發(fā)酵

為了給連續(xù)發(fā)酵提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，首先考察了C.saccharobutylicumDSM 13864以葡萄糖為底物分批發(fā)酵生產(chǎn)丁醇過程中的各重要參數(shù)（菌體濃度、pH值、殘?zhí)?、溶劑和有機(jī)酸）的變化情況，其結(jié)果如圖 1所示。從圖1中可以看出：隨著發(fā)酵的進(jìn)行，葡萄糖不斷地被消耗，在28 h左右葡萄糖濃度已經(jīng)低于3 g/L，發(fā)酵的最終殘留葡萄糖平均濃度為2.05 g/L。伴隨著葡萄糖的不斷消耗菌體濃度逐漸上升，到 28 h時菌體濃度達(dá)到最大值為 7.19 g/L。在發(fā)酵前期，葡萄糖被菌體利用首先產(chǎn)生乙酸和丁酸，兩種酸的積累使發(fā)酵液的pH值不斷下降；當(dāng)pH值下降到4.91時，菌體所處的環(huán)境不再適合其生長，此時菌體將乙酸和丁酸進(jìn)一步還原為其相應(yīng)的乙醇和丁醇，以緩解低pH值對其生長的影響。發(fā)酵結(jié)束后乙酸和丁酸的殘留量分別為1.68 g/L和0.69 g/L。分批發(fā)酵16 h后，溶劑的量迅速地上升，在48 h時，總?cè)軇┑臐舛冗_(dá)到最高值18.20 g/L，其中丙酮5.29 g/L、乙醇1.38 g/L、丁醇11.53 g/L，生產(chǎn)率為0.379 g/(L·h)，總?cè)軇┑寐蕿?.314 g/g。

2.2 不同稀釋率對連續(xù)發(fā)酵的影響

圖1 C.saccharobutylicum DSM 13864分批發(fā)酵時間進(jìn)程

圖2 不同稀釋率對C.saccharobutylicum DSM 13864四級連續(xù)發(fā)酵pH、菌體濃度和殘?zhí)堑挠绊?/p>

圖3 不同稀釋率對C.saccharobutylicum DSM 13864四級連續(xù)發(fā)酵總?cè)軇┊a(chǎn)量的影響

圖4 不同稀釋率對C.saccharobutylicum DSM 13864四級連續(xù)發(fā)酵總酸產(chǎn)量的影響

表1 不同稀釋率下C.saccharobutylicum DSM 13864四級連續(xù)發(fā)酵的參數(shù)

在連續(xù)發(fā)酵過程中，底物的補(bǔ)加速率會顯著影響菌體的生長和溶劑的生產(chǎn)，因此稀釋率是連續(xù)發(fā)酵的一個重要的影響因素[15]。稀釋率越高，則底物在罐中的停留時間越短，營養(yǎng)物質(zhì)與細(xì)胞的接觸時間越少，從而底物的利用率較低；稀釋率越低，則原料在罐中的停留時間越長，底物的利用率越高，但生產(chǎn)率將降低[16]。本研究采用下進(jìn)上出的四級連續(xù)發(fā)酵方式，考察了3個不同稀釋率0.03 h?1、0.05 h?1和0.1 h?1對連續(xù)發(fā)酵中各重要參數(shù)的影響，結(jié)果如圖 2～圖 4，各個稀釋率下一級罐和四級罐的發(fā)酵數(shù)據(jù)顯示在表 1中。在3個不同稀釋率下，一級罐（Ⅰ）的菌體濃度波動較大，3個稀釋率（0.03 h?1、0.05 h?1和0.1 h?1）條件下的一級罐的平均菌體濃度分別為2.19 g/L 、3.10 g/L和4.84 g/L；四級罐的平均菌體濃度分別為1.02 g/L、1.34 g/L和2.13 g/L，表明高稀釋率（0.1 h?1）有利于菌體的生長。然而高稀釋率（0.1 h?1）下的末級罐流出液中的殘留葡萄糖濃度較高，與稀釋率0.03 h?1（總?cè)軇┑寐?.208 g/g）和0.05 h?1（總?cè)軇┑寐?.248 g/g）相比，其總?cè)軇┑寐蕛H為0.255 g/g。稀釋率對連續(xù)發(fā)酵產(chǎn)溶劑的影響如圖 3所示，當(dāng)稀釋率為0.05 h?1時，一級罐（Ⅰ）在連續(xù)發(fā)酵100 h后溶劑產(chǎn)量趨于穩(wěn)定，其總?cè)軇┢骄a(chǎn)量為9.14 g/L（丁醇為5.96 g/L），生產(chǎn)率為0.457 g/(L·h)，是分批發(fā)酵[0.379 g/(L·h)]的1.21倍；而此稀釋率下四級罐（Ⅳ）流出液中總?cè)軇┳罡邽?1.57 g/L（其中丁醇7.29 g/L），四級發(fā)酵罐的總生產(chǎn)率僅為0.145 g/(L·h)。當(dāng)稀釋率為0.1 h?1時，一級罐的平均總?cè)軇┊a(chǎn)量為8.20 g/L（丁醇為5.56 g/L），四級罐（Ⅳ）流出液中的平均總?cè)軇┊a(chǎn)量為8.99 g/L（丁醇為6.14 g/L），其一級罐生產(chǎn)率和四級發(fā)酵罐的總生產(chǎn)率分別為 0.820 g/(L·h)和0.225 g/(L·h)。有文獻(xiàn)報(bào)道[17]在稀釋率為 0.3 h?1下總?cè)軇┑纳a(chǎn)率能達(dá)到2 g/(L·h)，但是其總?cè)軇┑漠a(chǎn)量卻低于8 g/L，這顯然不利于溶劑的下游分離提取。在連續(xù)發(fā)酵進(jìn)行456 h后將稀釋率下調(diào)至0.03 h?1，但其總?cè)軇┊a(chǎn)量與另外兩個稀釋率相比較低，這可能是由于太低稀釋率的條件下葡萄糖的補(bǔ)加速率無法完全滿足菌體進(jìn)入有利于溶劑生產(chǎn)所需要的培養(yǎng)基環(huán)境中。從圖 4中可以看出，0.1 h?1與0.03 h?1的稀釋率相比兩種酸的積累量相差不明顯，可能是由于稀釋率從0.1 h?1降到0.03 h?1后發(fā)酵罐中殘留的酸不能及時地被轉(zhuǎn)化為溶劑，且不能很快地流出發(fā)酵罐，從而使得兩個稀釋率下的酸積累量相近；而與 0.05 h?1的稀釋率相比兩種酸的累積量卻明顯升高，相比之下高稀釋率的確有利于酸的累積。在稀釋率為0.1 h?1時其四級罐中平均總酸為5.44 g/L，其中乙酸3.36 g/L，丁酸2.08 g/L。

2.3 不同溫度對連續(xù)發(fā)酵的影響

Glassner等[18]報(bào)道，在多級連續(xù)發(fā)酵進(jìn)入產(chǎn)溶劑期后降低發(fā)酵溫度，有助于提高丁醇和總?cè)軇┑漠a(chǎn)量。表2顯示了稀釋率為0.05 h?1下的不同溫度連續(xù)發(fā)酵的結(jié)果，結(jié)合之前關(guān)于溫度對C.saccharobutylicumDSM 13864菌體生長和丁醇生產(chǎn)的影響結(jié)果（數(shù)據(jù)未顯示）[19],其溫度控制為：一級和二級罐溫度恒定在 37 ℃，三級和四級罐的溫度相同并分別控制在30 ℃、33 ℃和37 ℃。一級、二級罐溫度控制在37℃主要是為了獲得生長旺盛的種子發(fā)酵液，而三級和四級主要用于考察不同溫度對溶劑積累的影響。表2列出了3種溫度條件下四級罐流出液中的各重要發(fā)酵參數(shù)。當(dāng)三級和四級罐的溫度控制在 33 ℃時，總?cè)軇┑漠a(chǎn)量為最高（13.69 g/L），其中丁醇產(chǎn)量為8.36 g/L。而在 30 ℃和 37 ℃條件下，總?cè)軇┑漠a(chǎn)量相差不明顯（11.39 g/L和11.57 g/L）。而對于酸的積累，隨溫度的升高總酸的積累量呈逐漸下降趨勢。在33 ℃條件下，溶劑得率（0.271 g/g）和生產(chǎn)率[0.171 g/(L·h)]均為最高水平，殘留葡萄糖濃度最低（9.57 g/L）。

表2 D=0.05 h?1時不同溫度控制下的連續(xù)發(fā)酵參數(shù)

3 結(jié) 論

本文以葡萄糖培養(yǎng)基進(jìn)行了四級連續(xù)發(fā)酵的初步研究，通過建立和優(yōu)化連續(xù)發(fā)酵工藝為以后使用廉價糖質(zhì)原料（如糖蜜、秸稈水解液等）進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，得出以下主要結(jié)論。

（1）與分批發(fā)酵相比，連續(xù)發(fā)酵一級罐中能獲得較高的溶劑生產(chǎn)率。在連續(xù)發(fā)酵研究中，丁醇的產(chǎn)量受稀釋率的影響較大，隨著稀釋率的增加，四級罐流出液中的溶劑濃度呈現(xiàn)下降趨勢，而菌體濃度逐漸升高。

（2）稀釋率為 0.05 h?1時，其總?cè)軇┊a(chǎn)量最高（11.57 g/L，其中丁醇7.29 g/L），一級罐的生產(chǎn)率為 0.457 g/(L·h)，是分批發(fā)酵[0.379 g/(L·h)]的 1.21倍，其總生產(chǎn)率為0.145 g/(L·h)。

（3）在0.05 h?1稀釋率下的變溫連續(xù)發(fā)酵表明低溫有利于溶劑的積累，當(dāng)一級和二級罐溫度控制在37 ℃，三級和四級罐溫度控制在33 ℃時，總?cè)軇┑漠a(chǎn)量最高（13.69 g/L，其中丁醇為8.36 g/L），生產(chǎn)率為 0.171 g/(L·h)。

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