呂 順，林 琳，向 蔚，陸劍鋒，葉應旺，姜紹通

(合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009)

水解明膠是一種低分子質量多肽，是以動物結締組織中的膠原蛋白為原料，經水解而制得的產品[1]。水解明膠除具有明膠所固有的絕大部分優(yōu)良理化性能外，經水解后，相對分子質量降低，在水中的溶解度增大，更易被人體吸收。明膠水解物除具有優(yōu)良的理化性能外，還具有多種生物活性，如魷魚皮[2-3]和河豚魚皮[4]明膠水解物及羅非魚骨明膠水解物[5]被發(fā)現(xiàn)具有清除自由基和抗氧化活性，鱈魚皮明膠[6]、海參明膠[7]和魷魚皮明膠[8]水解物被發(fā)現(xiàn)具有ACE抑制活性等。目前，水解明膠已廣泛應用于食品、醫(yī)藥、化妝品等方面[9]。

明膠水解的方法主要有酸法、堿法和酶法，其中使用較為廣泛的是酶法水解[10]。酶法水解明膠的過程中產生的污染物少，反應條件溫和，生產過程中能耗少，產品性能穩(wěn)定質量可靠，且整個生產過程易形成連續(xù)化生產，便于大批量生產。堿性蛋白酶[11]、木瓜蛋白酶[12]、復合蛋白酶[13]、胃蛋白酶[14]、Alcalase[15]等酶都被用于水解明膠或魚皮，生產水解明膠和多肽。

斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus)是安徽乃至全國的主要淡水養(yǎng)殖、加工品種，主要用于生產出口鮰魚片，鮰魚片加工中產生40%左右的下腳料，主要是魚皮(10%)、魚骨、內臟等，目前這部分副產物主要用來生產魚粉，其中的膠原蛋白/明膠資源被大大浪費。從鮰魚皮中提取明膠、制備水解明膠，既可以減少加工廢棄物對環(huán)境的污染，又可增加其附加值。本實驗以鮰魚皮明膠為原料，通過單因素和正交試驗確定堿性蛋白酶水解明膠的最佳工藝條件，為水解明膠的生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

斑點叉尾鮰魚(Ictalurus punctatus)魚皮 安徽明光永言水產食品有限公司。

堿性蛋白酶 北京奧博星生物技術有限公司；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

RE52-86A旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器有限公司；FSH-ZA型可調高速勻漿機 江蘇省金壇市華榮儀器制造有限公司；HH-2孔數(shù)顯水浴鍋 江蘇金壇市環(huán)宇科學儀器廠；SP-752紫外分光光度計 上海光譜儀器有限公司；FD-1型真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；CT15RT臺式高速冷凍離心機 上海天美生化儀器設備工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鮰魚皮明膠的提取[16]

稱取一定量的鮰魚皮，剪成小塊，按1:6(m/V)加入0.05mol/L NaOH溶液浸泡30min，水洗至中性，按1:6再加0.2%硫酸溶液浸泡30min，水洗至中性，最后用熱水抽提過夜，4000r/min離心20min，棄去沉淀不溶物，得到粗膠制品，于冷凍干燥機中凍干。

1.3.2 鮰魚皮明膠水解工藝

稱取制備的明膠，用蒸餾水溶解制成相應質量濃度的明膠溶液。采用堿性蛋白酶對明膠溶液進行水解，水解過程中用電動攪拌機不斷攪拌，水解結束后，將水解液置于沸水浴中煮沸10min以滅酶活，終止水解反應，然后迅速冷卻至室溫。將水解液以4000r/min離心15min，棄去沉淀并記錄上清液體積。

1.3.3 明膠水解度的測定

采用紫外分光光度法[17]測定明膠水解度，并對此方法進行改進。

1.3.3.1 明膠溶液測試質量濃度的確定

通過不同加酶量(0.1、0.2、0.3、0.5、1.0、2.0、3.0g/100mL)對明膠水解程度的影響實驗，對明膠溶液的質量濃度與吸光度的關系進行研究，確定明膠溶液的測試質量濃度。具體操作為：在pH 10.0、10g/100mL的明膠溶液中，改變堿性蛋白酶加入量，并在溫度為50℃恒溫水浴鍋中，使明膠水解2h。反應完成后，將明膠配成質量濃度為10-2、10-3、10-4g/mL的測試液進行測定，以確定測試液質量濃度。

1.3.3.2 明膠水解液水解度與吸光度的線性相關性

取9支試管(含1mL pH10.0的明膠溶液)于50℃水浴鍋中預熱10min，各管中分別加入1mL 6000U/mL堿性蛋白酶酶液，在50℃條件下對明膠進行水解，酶解時間分別為5、10、15、20、30、60、120、240、480min。水解完成后，于100℃煮沸5min滅酶活，4000r/min離心15min，棄去沉淀并記錄上清液體積。用蒸餾水將上清液定容到適當?shù)馁|量濃度，在波長為275nm處測定吸光度。吸光度測定完后，采用茚三酮法[18]測定水解液的水解度(DH)。水解度按公式(1)計算。

式中：h為水解后每克蛋白質被裂解的肽鍵毫摩爾數(shù)/(mmol/g)；htot為每克原料蛋白質的肽鍵毫摩爾數(shù)/(mmol/g)，明膠取8.41mmol/g。

以水解液的吸光度為橫坐標，水解度為縱坐標，繪制水解液吸光度和水解度的關系圖，確定線性方程和相關性以及適用的吸光度范圍。

1.3.4 明膠水解液氮回收率(NR)的測定

采用堿性蛋白酶對鮰魚皮明膠進行水解后，記錄水解離心后上清液的總體積，取5mL水解液，用凱氏定氮法消化、定氮，測定上清液中蛋白含量，則氮回收率按式(2)計算。

1.3.5 明膠水解液平均分子質量的測定[19]

將分子質量已知的標準品K2CrO4(Mr=196)、還原型谷胱甘肽(Mr=307)、VB12(Mr=1355)、細胞色素C(Mr=12300)和胃蛋白酶(Mr＝35500)各10mg，分別溶于1mL洗脫磷酸鹽緩沖液(0.1mol/L，pH7.0)中，配制質量濃度為10mg/mL的標準溶液。

取已處理好的交聯(lián)葡聚糖凝膠(Sephadex G-25)裝柱，并用洗脫液平衡。分別加入各標準品1mL，在280nm波長處檢測其吸光度，并記錄各標準品出現(xiàn)最大吸收峰時洗脫液的流出體積(mL)。

以標準品重鉻酸鉀、還原型谷胱甘肽、VB12、細胞色素C和胃蛋白酶洗脫體積(V)為縱坐標，標準品分子質量的對數(shù)(lgMr)為橫坐標，繪制分子質量標準曲線，根據分子質量標準曲線，計算明膠水解液的平均分子質量。

1.3.6 堿性蛋白酶水解明膠的最佳條件確定

選用堿性蛋白酶作為水解明膠用酶，對酶解溫度(35、40、45、50、55℃)、pH值(8.0、9.0、9.5、10.0、10.5)、酶解時間(1、2、3、4、5h)、加酶量(1000、2000、3000、4000、5000U/mL)進行單因素試驗，然后采用四因素三水平正交試驗確定堿性蛋白酶水解明膠的最佳條件。

2 結果與分析

2.1 明膠水解度測定方法的確定

分別測定質量濃度為10-2、10-3、10-4g/mL的明膠溶液經水解后在275nm波長處的吸光度(A275nm)，以加酶量為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制加酶量與明膠水解液吸光度之間的關系曲線。

從圖1可以看出，當明膠溶液的質量濃度為10-3g/mL時，明膠的水解度與吸光度(A275nm)之間的關系能正確地反映出明膠的水解反應規(guī)律，其他兩種質量濃度的測試結果都有明顯的誤差，難以判斷明膠的水解。因此，確定采用紫外分光光度法測定明膠溶液水解度的適宜質量濃度為10-3g/mL。

圖1 酶用量與明膠溶液質量濃度的關系Fig.1 Relationship between enzyme loading and gelatin concentration

取堿性蛋白酶，在其適宜作用條件下，對明膠溶液分別水解5、10、15、20、30、60、120、240、480min。水解完成后采用紫外分光光度法測定水解液的吸光度(A275nm)，并采用傳統(tǒng)水解度測定方法測定明膠的水解度，以吸光度(A275nm)為橫坐標，以水解度為縱坐標作圖。得到：當吸光度在0.082～0.708的范圍內時，水解液的吸光度與水解度成線性關系，其線性相關方程為：Y=49.39X－0.443(R2=0.996)，式中：Y為水解液的水解度/%；X為水解液在275nm波長處的吸光度。

通過本實驗的研究發(fā)現(xiàn)，在明膠水解液的質量濃度為10-3g/mL時，其水解度與吸光度(A275nm)呈線性相關。因此，可以測定明膠水解液的A275nm值，利用水解度與吸光度的線性關系方程，計算得到明膠水解液的水解度。

目前，測定蛋白質水解度的方法主要有三硝基苯磺酸法(TNBS)、鄰苯二甲醛(OPA)法、茚三酮法、甲醛滴定法和pH-Stat法等。甲醛滴定法是國內廣泛應用于測定蛋白質水解程度的方法，操作較簡單，但脯氨酸與甲醛作用后，生成不穩(wěn)定化合物，因此采用甲醛滴定法測定富含脯氨酸的原料，其結果偏低[20]。明膠水解液中脯氨酸含量較高，因此甲醛滴定法不適用于測定明膠水解物的水解度。pH-Stat法的優(yōu)點在于操作簡單、快速、可重復性高，通常被用于水解度的連續(xù)測定。但這種方法僅適用于中性及堿性(pH＞7)或pH＜3的酸性溶液中進行的水解，并且需要特別的儀器控制水解過程中的pH值，同時這種方法還需要用其他的方法進行校正，有研究[21]表明pH-Stat法的測定結果偏高。TNBS法測定的結果較準確，但其所用試劑不易獲得且測定過程耗時較長，不適于實時監(jiān)測水解度[22]。OPA法操作簡單，可快速測定水解度，但由于其需要采用熒光光度計測定，因此應用受到一定的限制[23]。茚三酮比色法操作簡單，測定快速，但是由于不同氨基酸和水合茚三酮顯色不同，對測量結果有部分偏差，使測定結果偏低[24]。

本實驗對已有的利用紫外分光光度法測定明膠水解度的方法進行了改進，操作簡單，結果較準確，可快速測定明膠的水解度，不僅適用于實驗室中對明膠水解液水解度的測定，也便于工廠化生產時監(jiān)控明膠水解度。后續(xù)實驗均采用此方法測定明膠水解液的水解度。

2.2 堿性蛋白酶水解明膠的最佳條件確定

2.2.1 單因素試驗結果

2.2.1.1 酶解溫度對堿性蛋白酶水解明膠的影響

圖2 酶解溫度對堿性蛋白酶水解明膠的影響Fig.2 Effect of temperature on gelatin hydrolysis by alkaline protease

由圖2可知，堿性蛋白酶水解明膠的最適溫度為50℃，此時的水解度最高，為33.52%，當酶解溫度達到55℃，可能是高溫引起堿性蛋白酶失活而使水解度有所降低。

2.2.1.2 pH值對堿性蛋白酶水解明膠的影響

圖3 pH值對堿性蛋白酶水解明膠的影響Fig.3 Effect of pH on gelatin hydrolysis by alkaline protease

由圖3可知，pH8時堿性蛋白酶對明膠的水解作用較弱，水解度較低，而當pH值達到9.5時，堿性蛋白酶對明膠的水解作用最強。當pH值繼續(xù)增大時，堿性蛋白酶對明膠的水解作用減弱。

2.2.1.3 酶解時間對堿性蛋白酶水解明膠的影響

圖4 酶解時間對堿性蛋白酶水解明膠的影響Fig.4 Effect of time on gelatin hydrolysis by alkaline protease

由圖4可知，水解初期(酶解時間為1h)，水解度增長緩慢，而在酶解2～4h這段時間，水解度上升較快，因為堿性蛋白酶需要在其最適溫度下活化一段時間，酶的活性中心方能被激活，達到其最佳水解效果。當酶解時間為4h時，酶的水解作用最大，此時水解度達到最大值。酶解4h后，因為底物濃度下降，可以與酶活性中心結合的底物減少，水解趨于平衡，水解度基本不增長，此時，繼續(xù)延長酶解時間對水解效果的影響不大。

2.2.1.4 加酶量對堿性蛋白酶水解明膠的影響

圖5 加酶量對堿性蛋白酶水解明膠的影響Fig.5 Effect of enzyme loading on gelatin hydrolysis by alkaline protease

由圖5可知，堿性蛋白酶的加入量會影響明膠的水解效果。當加酶量較少時，堿性蛋白酶的水解效果不好；當堿性蛋白酶的加入量為3000U/mL，水解效果最好，此后繼續(xù)增加加酶量，對水解度的影響不大。

2.2.2 堿性蛋白酶水解明膠的正交試驗

表1 正交試驗因素水平、結果及分析TTaabbllee 11 OOrrtthhooggoonnaall aarrrraayy ddeessiiggnn aarrrraannggeemmeenntt aanndd rreessuullttss

在上述單因素試驗的基礎上，綜合考慮各因素作用，以酶解溫度、pH值、酶解時間和加酶量為主要因素，以水解度為評價指標，采用四因素三水平正交試驗確定堿性蛋白酶的最佳水解條件。正交試驗因素水平及試驗結果、極差分析見表1。第6組試驗得到水解液的水解度最高，即加酶量3000U/mL、酶解溫度50℃、pH10.0、酶解時間3h，此時水解度為34.79%。通過極差分析可知，影響堿性蛋白酶對明膠水解效果的主次因素為D＞A＞B＞C，即加酶量＞酶解溫度＞pH值＞酶解時間。根據極差分析結果可知堿性蛋白酶水解明膠的最佳工藝條件為A2B2C1D3，即加酶量4000U/mL、酶解溫度50℃、pH值為9.5、酶解時間3h，經驗證實驗可知，此條件下得到水解液的水解度為35.12%，較直觀分析第6組試驗得到的水解液的水解度高出了0.33%。

在最佳工藝條件制備得到的明膠水解物的氮回收率為65.3%，產率為47.0%，經Sephadex G-25凝膠過濾層析可知水解液的分子質量分布是連續(xù)的，其平均分子質量為5500D。實驗結果表明，通過以上工藝條件水解制得的明膠水解物的水解度較高，獲得的水解物分子質量分布范圍較寬，可進一步對其進行分離，獲得不同分子質量的組分，以滿足不同的應用要求。

3 結 論

3.1 采用改進的紫外分光光度法測定明膠水解度，明膠水解液質量濃度為10-3g/mL時，水解液的吸光度(A275nm)能正確地反映出明膠的水解反應規(guī)律，吸光度(A275nm)在0.082～0.708范圍內時，吸光度與水解度的線性相關方程為：Y=49.39X－0.443(R2=0.996)，通過此方程可根據水解液在275nm波長處的吸光度計算水解度。此方法較傳統(tǒng)的水解度測定方法更為簡單、快速。

3.2 選用堿性蛋白酶對明膠進行水解，采用單因素試驗和正交試驗，確定堿性蛋白酶水解明膠的最佳工藝條件。各因素對堿性蛋白酶水解明膠的影響作用不同，其中加酶量對水解度的影響最大，酶解溫度和pH值次之，酶解時間對水解度的影響最小。堿性蛋白酶水解明膠的最優(yōu)工藝條件為加酶量4000U/mL、酶解溫度50℃、pH值為9.5、酶解時間3h，此時的水解度達到35.12%。

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