李 鑫，李建科，董 攀，鄧文輝

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌大學(xué)生物質(zhì)轉(zhuǎn)化教育部工程研究中心，江西南昌 330047)

漆酶(Laccasc，EC1.10.3.2.)，是一種含銅的多酚氧化酶，1883年首次從日本漆樹的汁液中發(fā)現(xiàn)［1］，隨后人們研究發(fā)現(xiàn)它廣泛存在于植物［2］、昆蟲［3］和高等真菌中［4］。漆酶可以催化氧化酚類化合物，脫去羥基上的電子或質(zhì)子，形成自由基，導(dǎo)致酚類及木素類化合物降解，同時(shí)使分子氧被還原為水［5］，由于它催化性能特殊，作用底物廣泛，引起人們越來越濃厚的興趣，成為生物、化學(xué)和環(huán)境領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。漆酶最突出的功能是降解紙漿中的木質(zhì)素、漂白廢水、去除廢水中的有毒酚類物質(zhì)，在造紙行業(yè)中具有非常大的應(yīng)用前景。目前，國內(nèi)外對漆酶的研究有兩個(gè)方向，一個(gè)是尋找合適的載體進(jìn)行漆酶基因的異源表達(dá)，但白腐真菌在活性宿主的高效表達(dá)較為困難，使其仍然處于探索階段［6－8］;所以對漆酶的研究主要集中在菌種篩選、培養(yǎng)條件優(yōu)化、酶的固定化和對污染物的處理等方面［9］。真菌漆酶的合成水平與菌株本身的產(chǎn)酶能力密切相關(guān)，同時(shí)還受到環(huán)境條件的影響，如碳源、氮源、誘導(dǎo)劑等多種因素［10－13］，誘導(dǎo)劑添加與否、添加量及添加時(shí)間對漆酶酶活的影響十分顯著［14］。本實(shí)驗(yàn)在液體培養(yǎng)的條件下，研究各種因素對貝殼狀革耳菌P.conchatus合成漆酶能力的影響，找出最適合產(chǎn)酶的條件，最大程度的提高漆酶酶活［15－16］。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

貝殼狀革耳菌Panus conchatus 由華南理工大學(xué)制漿造紙工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供;葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、酵母膏、蛋白胨、牛肉浸膏 天津市冠前華工經(jīng)銷部;五水合硫酸銅(CuSO4·5H2O)、硫酸銨、苯酚、苯甲酸、尿素 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純;2，2－聯(lián)氮－二(3－乙基－苯并噻唑－6－磺酸)二銨鹽(ABTS)、愈創(chuàng)木酚 Sigma公司;豆粉 安陽市奇天生物技術(shù)有限公司;麥麩、稻草 購于當(dāng)?shù)厥袌觥?/p>

LRH－250生化培養(yǎng)箱 上海恒一科技有限公司;LS－C50型立式壓力蒸汽滅菌器 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠;SW－CJ－1FD單人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;UV－7504紫外可見分光光度計(jì) 上海欣茂儀器有限公司;PY150－2/2搖床 武漢匯誠生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件 液體種子培養(yǎng)基:土豆汁30%，葡萄糖20g/L，蛋白胨1g/L，MgSO43g/L，KH2PO43g/L，pH自然，玻璃珠2顆。在制作種子培養(yǎng)基時(shí)，往搖瓶中加2顆玻璃珠，振蕩培養(yǎng)時(shí)，由于有玻璃珠的存在，菌絲不會長成大顆粒的菌絲球，而是形成渾濁均一的細(xì)絲狀液體，用移液槍直接吸取定量的菌絲液即可。產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基:土豆汁30%，葡萄糖20g/L，蛋白胨1g/L，MgSO43g/L，KH2PO43g/L，pH自然。培養(yǎng)條件:在250mL三角瓶中，裝液量50mL，接種量10mL，培養(yǎng)溫度30℃，轉(zhuǎn)速150r/min，振蕩培養(yǎng)12d。

1.2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化 碳源篩選:只改變產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的碳源種類，濃度均為20g/L，其他條件不變，找出最適合產(chǎn)漆酶的碳源;氮源篩選:只改變產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的氮源種類，濃度均為1g/L，其他條件不變，找出最適合產(chǎn)漆酶的氮源;最適C/N:篩選出最適的碳源氮源后，固定碳源濃度為20g/L，改變氮源的含量，使得 C/N 比分別為 5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1。

1.2.3 誘導(dǎo)劑的篩選 在優(yōu)化后的初始培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)劑，選擇麥麩、稻草、Cu2+、ABTS、愈創(chuàng)木酚、苯酚、苯甲酸幾種物質(zhì)作為誘導(dǎo)劑，初步篩選出有誘導(dǎo)效果的誘導(dǎo)劑，并做單因素實(shí)驗(yàn)，確定誘導(dǎo)劑的最佳添加量。

1.2.4 Cu2+添加時(shí)間及添加量 在初始培養(yǎng)基中首先添加麥麩，然后在不同的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，添加不同濃度Cu2+，找出Cu2+最適合的添加時(shí)間及添加量［14］。

1.2.5 分析測定方法

1.2.5.1 菌絲干重的測定方法 取出250mL的三角瓶中的發(fā)酵液，發(fā)酵液用8層紗布過濾后，轉(zhuǎn)移至稱量瓶，于100～105℃烘箱中烘至絕干，稱重。

1.2.5.2 漆酶活力測定漆酶活力的測定 以ABTS為底物，酶液經(jīng)適當(dāng)稀釋后，用等體積酶液和0.5mmol/L ABTS溶液反應(yīng)，測定反應(yīng)前3min內(nèi)420nm處吸光值的增加量，定義每分鐘使1μmol ABTS轉(zhuǎn)化所需要的酶量為1個(gè)漆酶活力單位(U)［17］。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種菌齡的確定

種子質(zhì)量的優(yōu)劣直接關(guān)系到發(fā)酵液中酶活的高低。菌體剛開始時(shí)生長緩慢;隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，菌體吸收培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，菌絲重量迅速增加，生命力旺盛;繼續(xù)培養(yǎng)，營養(yǎng)物質(zhì)消耗，代謝產(chǎn)物開始累積;之后菌體開始衰退。接種時(shí)間應(yīng)選在菌體生命力旺盛的對數(shù)時(shí)期。如圖1所示，為P.conchatus生長曲線。

從圖1可以看出，菌體生長的對數(shù)期為第3～6d，在第5d菌絲干重急劇增長，此時(shí)菌體生命力最旺盛，之后便轉(zhuǎn)入生長穩(wěn)定期。因此確定菌體的接種種齡為5d。

圖1 生長曲線Fig.1 Growth curve

2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化

2.2.1 碳源對漆酶合成的影響 真菌細(xì)胞干重的一半是由碳組成的［18］，碳源是菌體碳架的來源，并為菌體生長提供能量。考察五種不同的碳源［18－19］對P.conchatus合成漆酶的影響。

從圖2可以看出，以葡萄糖為碳源的漆酶酶活最高，達(dá)到5693U·L－1。P.conchatus對碳源的利用率依次為葡萄糖＞蔗糖、麥芽糖＞可溶性淀粉、豆粉。葡萄糖是單糖，蔗糖和麥芽糖是二糖，可溶性淀粉和豆粉是多糖，說明P.conchatus更易利用分子量較小的碳源。

圖2 碳源對漆酶合成的影響Fig.2 Effect of carbon source on laccase production

2.2.2 氮源對漆酶合成的影響 氮源對菌體合成蛋白質(zhì)，核酸等含氮物質(zhì)有重要作用，直接關(guān)系到后期的產(chǎn)酶。不同來源的氮對菌體生長的促進(jìn)作用不同，考察五種氮源對白腐菌產(chǎn)酶的影響［18－19］。

從圖3可以看出，以酵母膏為氮源的漆酶酶活最高，達(dá)到6023U·L－1。P.conchatus對氮源的利用率依次為酵母膏＞蛋白胨＞牛肉浸膏＞硫酸銨＞尿素。酵母膏是微生物來源的有機(jī)氮，蛋白胨和牛肉浸膏是動物來源的有機(jī)氮，硫酸銨和尿素是無機(jī)氮，總體來說，P.conchatus對有機(jī)氮的利用率比對無機(jī)氮的利用率高;在有機(jī)氮中，微生物來源的氮比動物來源的氮好。

2.2.3 C/N比對產(chǎn)酶的影響 以葡萄糖為碳源，酵母膏為氮源，確定葡萄糖的濃度為20g/L，改變酵母膏的含量，使得 C/N 比分別為 5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1。

從圖4可以看出，當(dāng)C/N比為15時(shí)，P.conchatus合成漆酶的酶活最高，達(dá)到8795U·L－1。C/N比較小時(shí)，氮源充足，發(fā)酵液較粘稠，影響菌絲體對氧的吸收;C/N比較大時(shí)，碳源充足，對菌絲體生長有利，但不利于菌體產(chǎn)酶;只有當(dāng)C/N比為15∶1時(shí)，菌絲體生長良好，且有利于漆酶分泌。

圖3 氮源對漆酶合成的影響Fig.3 Effect of nitrogen source on laccase production

圖4 C/N比對漆酶合成的影響Fig.4 Effect of C/N on laccase production

2.3 誘導(dǎo)劑對白腐菌分泌漆酶的影響

漆酶是一種能夠降解木質(zhì)素的含銅的多酚氧化酶，在白腐菌產(chǎn)漆酶的過程中，加入一些與木質(zhì)素有相似結(jié)構(gòu)的化合物，能夠誘導(dǎo)漆酶的合成。P.conchatus是一株表達(dá)效率較高白腐真菌，它在誘導(dǎo)劑的作用下，能合成高酶活的漆酶，比一般白腐菌合成漆酶的酶活高若干倍。因此選擇合適的誘導(dǎo)劑及其用量，是漆酶優(yōu)化工藝中非常重要的步驟。

2.3.1 誘導(dǎo)劑的篩選 微生物酶類分為組成酶和誘導(dǎo)酶。組成酶是指微生物無論在任何培養(yǎng)基中，總是適量地存在的一些酶類;誘導(dǎo)酶是依賴于酶作用底物或底物結(jié)構(gòu)類似物的存在而合成的酶類。漆酶胞外組成酶產(chǎn)量較低，當(dāng)添加與木質(zhì)素或木質(zhì)素衍生物相關(guān)的芳烴類和酚類，能顯著提高漆酶酶活［17］。

根據(jù)參考的文獻(xiàn)資料［20］，在優(yōu)化后的初始培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)劑，選擇麥麩、稻草、Cu2+、ABTS、愈創(chuàng)木酚、苯酚、苯甲酸幾種物質(zhì)作為誘導(dǎo)劑，初步篩選出有誘導(dǎo)效果的誘導(dǎo)劑。其中麥麩、稻草的含量為1%，Cu2+、ABTS、愈創(chuàng)木酚、苯酚、苯甲酸的濃度為1mmol/L，同時(shí)以不加誘導(dǎo)劑為空白做對比。

從圖 5可以看出，麥麩、Cu2+和 ABTS對P.conchatus有顯著的誘導(dǎo)效果，其中以Cu2+的效果最為突出，稻草、愈創(chuàng)木酚、苯酚、苯甲酸對P.conchatus的誘導(dǎo)效果不是很明顯;而ABTS價(jià)格昂貴，所以選擇麥麩和Cu2+作為該菌的誘導(dǎo)劑。

圖5 誘導(dǎo)劑的篩選Fig.5 Inducers screening

2.3.2 誘導(dǎo)劑添加量單因素實(shí)驗(yàn) 麥麩可以作為木質(zhì)素類似物，能夠誘導(dǎo)漆酶的合成，同時(shí)，麥麩也作為碳源，為菌絲生長提供能量。通過麥麩添加量的單因素實(shí)驗(yàn)，找出麥麩的最適添加量。

從圖6可以看出，當(dāng)麥麩含量為1.5%時(shí)，漆酶酶活最高，達(dá)到24464U·L－1，漆酶酶活最高;麥麩含量過低，不足以誘導(dǎo)菌體產(chǎn)酶;麥麩含量過高，影響培養(yǎng)基中含氧量，菌體生長欠佳，不利于漆酶合成。

圖6 麥麩的添加量對產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of wheat bran addition on laccase production

漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，在培養(yǎng)過程中加入適當(dāng)濃度的Cu2+，能誘導(dǎo)P.conchatus合成漆酶，顯著提高漆酶酶活。

從圖7可以看出，當(dāng)Cu2+濃度為1mmol/L時(shí)，漆酶酶活最高，達(dá)到 40599U·L－1，在濃度為 0.5～2mmol/L時(shí)，對漆酶合成有促進(jìn)作用;當(dāng)Cu2+濃度為2mmol/L時(shí)，酶活為8903U·L－1，與不加誘導(dǎo)劑時(shí)的酶活8795U·L－1相當(dāng)。過高濃度的Cu2+對菌體有毒性，使得微小的菌絲體難以存活，抑制菌體生長，不但沒有促進(jìn)，反而是抑制了漆酶的合成。此時(shí)，Cu2+對P.conchatus誘導(dǎo)合成漆酶的規(guī)律是，低濃度具有促進(jìn)作用，高濃度具有抑制作用。

2.3.3 誘導(dǎo)劑組合實(shí)驗(yàn) 選擇麥麩和Cu2+的最適添加量(1.5%麥麩與1mmol/L Cu2+搭配)，將兩者同時(shí)添加到初始培養(yǎng)基中，作為組合誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)P.conchatus合成漆酶。

從圖8可以看出，將麥麩和Cu2+兩種誘導(dǎo)劑進(jìn)行組合，比單獨(dú)使用一種誘導(dǎo)劑效果更好，兩種誘導(dǎo)劑共同作用使酶活達(dá)到51004U·L－1。

2.3.4 Cu2+添加時(shí)間及添加量 根據(jù)2.3.2及2.3.3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將麥麩和Cu2+兩種誘導(dǎo)劑一起添加到培養(yǎng)基中，能顯著提高Panus conchatus合成漆酶的能力，麥麩和Cu2+對Panus conchatus產(chǎn)酶有誘導(dǎo)效果，麥麩可以作為誘導(dǎo)劑添加到培養(yǎng)基中，又可作為培養(yǎng)基的碳源，對漆酶合成沒有毒性，但Cu2+對菌絲體生長有毒性，在起始培養(yǎng)基中加入Cu2+時(shí)，菌絲體的生長過程受到抑制，微小的菌絲體對Cu2+毒性的耐受度差而死亡，最終使產(chǎn)酶僅由一些較大的菌絲體來完成，若Cu2+濃度超過一定界線，白腐菌合成漆酶的能力反而下降。因此設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，在初始培養(yǎng)基中首先添加麥麩，然后在不同的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，添加不同濃度 Cu2+，找出 Cu2+最適合的添加時(shí)間及添加量［14］。

圖7 Cu2+濃度對產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of Cu2+concentration on laccase production

圖8 組合誘導(dǎo)劑對合成漆酶的影響Fig.8 Effect of inducers combination on laccase production

從圖9可以看出，在發(fā)酵第4d，添加Cu2+使其濃度為3mmol/L，漆酶酶活能達(dá)到101968 U·L－1。從時(shí)間上分析，在第 4d添加 Cu2+酶活最高，此時(shí)P.conchatus處于對數(shù)期，菌絲體旺盛，生命力強(qiáng)，Cu2+毒性對菌絲體的影響最弱，Cu2+能充分發(fā)揮誘導(dǎo)作用;若在起始時(shí)添加Cu2+，雖然對漆酶合成有促進(jìn)作用，但Cu2+的毒性會使一些生命力較弱的菌體死亡，使得發(fā)酵液酶活不是很高;在第2d添加Cu2+，菌絲體還處于生長延滯期，Cu2+同樣會對菌絲體的生長產(chǎn)生毒性;在第6d添加Cu2+，此時(shí)的菌絲體已經(jīng)即將進(jìn)入穩(wěn)定期，開始分泌漆酶，Cu2+的添加不會對菌絲體產(chǎn)生明顯的毒性，但是誘導(dǎo)時(shí)期偏晚，最終酶活不夠高。圖7中，在初始培養(yǎng)基(即第0天)中添加1mmol/L Cu2+的酶活最高，為51004U·L－1;圖9中改變Cu2+添加時(shí)間，Cu2+的最適添加量也隨之改變，當(dāng)Cu2+濃度為3mmol/L時(shí)酶活最高，為101968 U·L－1。由此可見，Cu2+不同的添加時(shí)間及添加量，對產(chǎn)漆酶酶活有很大影響。

圖9 Cu2+添加時(shí)間及添加量對合成漆酶的影響Fig.9 Effect of Cu2+add quantity and add time on laccase production

3 結(jié)論

3.1 根據(jù)P.conchatus的生長曲線可知，該菌株的對數(shù)生長期為4～8d，其最適接種種齡為5d。

3.2 P.conchatus的最優(yōu)碳源是葡萄糖，對碳源的利用順序依次是單糖＞二糖＞多糖;最優(yōu)氮源是酵母膏，對氮源的利用順序依次是微生物來源氮＞動物來源氮＞無機(jī)氮;最適C/N比為15。

3.3 麥麩、Cu2+和ABTS對P.conchatus誘導(dǎo)作用比較明顯;以麥麩為誘導(dǎo)劑，當(dāng)含量為1.5%時(shí)，酶活達(dá)到27880U·L－1;以Cu2+為誘導(dǎo)劑，當(dāng)濃度為1mmol/L時(shí)，酶活達(dá)到 40599 U·L－1;若將 1.5%麥麩與1mmol/L Cu2+搭配，比單獨(dú)使用一種誘導(dǎo)劑的效果更好，能達(dá)到 51004U·L－1。

3.4 在發(fā)酵第4d添加3mmol/L Cu2+，漆酶酶活能達(dá)到101968U·L－1，比在初始培養(yǎng)基中添加1mmol/L Cu2+所達(dá)到的酶活高了將近兩倍。

3.5 Cu2+對P.conchatus合成漆酶具有誘導(dǎo)性和毒性，若在培養(yǎng)初期加入Cu2+，其作用表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)，高濃度抑制;培養(yǎng)一段時(shí)間再加入Cu2+，菌絲體耐受力增強(qiáng)，Cu2+毒性減弱，能充分發(fā)揮誘導(dǎo)作用。

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