王園園，汪盈盈，汪電雷

（1.亳州職業(yè)技術學院藥學院，安徽亳州236800；2.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽合肥230031）

藤黃中藤黃總酸提取工藝研究

王園園1，2，汪盈盈1，汪電雷2

（1.亳州職業(yè)技術學院藥學院，安徽亳州236800；2.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽合肥230031）

目的：優(yōu)選中藥藤黃中藤黃總酸的提取工藝.方法：采用正交試驗法，以藤黃酸含量和浸膏得率為評價指標，對乙醇濃度、溶劑量、提取時間及提取次數(shù)4種因素進行了研究.結果：優(yōu)選的提取工藝為：90%乙醇，5倍量，提取3次，每次1小時.結論：正交試驗優(yōu)選的藤黃中藤黃總酸提取工藝簡便、穩(wěn)定、可行.

藤黃；藤黃總酸；提取工藝；正交試驗

藤黃Resina Garciniae系藤黃科（Guttiferae）植物藤黃樹Garcinia hanburyi Hook.f.的干燥樹脂[1]，藤黃性寒，有毒，味酸、辛、澀，有破血散結、解毒、止血、殺蟲之功效，自古以來就用來治療瘰疬、癰疸、癤腫等頑疾[2].藤黃總酸是從藤黃中提取的活性成分，主要由藤黃酸、新藤黃酸、異藤黃酸等組成的混合物.研究發(fā)現(xiàn)藤黃總酸對人肝癌、肺腺癌、乳腺癌、胃癌等有抑制作用，對腫瘤轉(zhuǎn)移有良好抑制作用等.本文采用正交試驗法，以藤黃酸含量和浸膏得率為評價指標[3]，確定藤黃總酸最佳提取工藝.

1 儀器與試藥

1.1 儀器

沃特世e2695高效液相色譜儀，Empower色譜工作站，R-205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，DZF-200型真空干燥箱，Sartorious電子天平，超聲波清洗器.

1.2 試藥

藤黃酸對照品安徽中醫(yī)學院自制（含量=99%）

藤黃藥材購于安徽亳州中藥材交易市場，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學中藥教研室王德群教授鑒定為藤黃科植物藤黃(Garcinia Hanburryi)的干燥樹脂.

2 方法與結果

2.1 正交試驗

取中藥藤黃10g，精密稱定.選取乙醇濃度（%）、乙醇用量（倍）、提取時間(h)、提取次數(shù)(次)4個因素，每個因素3個水平，按照正交L9(34)正交試驗表進行試驗，以期得到這些因素對藤黃酸提取率影響的變化趨勢和主次順序.因素水平安排表見表1.

表1 提取因素水平表

2.2 干浸膏得率測定[4]

分別將正交試驗各組提取液加入到干燥至恒重的圓底燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至濃稠，60℃真空干燥箱干燥40min，移至干燥器中冷卻30min，稱重，計算浸膏得率.結果見表2.

2.3 含量測定

2.3.1 對照品溶液的制備

精密稱取藤黃酸對照品10.57mg，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋定容，制成含量為1.057mg/ml的藤黃酸對照品溶液備用.

2.3.2 供試品溶液的制備[5-6]

精密稱取藤黃提取物0.1g，置于100ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋定容.精密吸取1ml以甲醇定容于100mL容量瓶中，用0.45μm微孔濾膜過濾，續(xù)濾液作為樣品溶液備用.

2.3.3 色譜條件及專屬性考察

沃特世e2695高效液相色譜儀；Empower色譜工作站；色譜柱：大連依利特ODS C18（250mm× 4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸（98:2）；流速：1.0ml/min；柱溫25℃，檢測波長360nm；進樣量：10μl.在該色譜條件下藤黃酸和峰2分離度為1.67，與峰4分離度為1.77，能較好的分離，理論塔板不低于5000.見Fig.1.

圖1-A 藤黃酸對照品HPLC圖

圖1-B 藤黃提取物樣品HPLC圖

2.3.4 線性關系考察

精密量取1ml對照品溶液以甲醇定容于100ml容量瓶中，分別精密吸取2μl、4μl、10μl、15μl、20μl、25μl進樣，測定峰面積.以對照品進樣量（μg）為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，計算回歸方程為：得回歸方程Y=1280242.10x -6940.85（r=0.9999），表明線性關系良好.

2.3.5 精密度試驗

精密吸取藤黃酸濃度為10.57μg/ml對照品溶液10μl，重復進樣6次，測定藤黃酸峰面積，RSD為0.3%，說明本試驗進樣精密度良好.

2.3.6 重復性試驗

取同一批次藤黃提取物樣品，按供試品溶液制備方法處理樣品6份，按上述色譜條件操作，進樣10μl，測定藤黃酸峰面積，RSD為0.6%，表明該法的重復性好.

2.3.7 穩(wěn)定性試驗

室溫條件下，精密吸取已知濃度（10.80μg/ml）的藤黃提取物樣品溶液10μl，于0、2、4、8、10、12h進樣測定，結果藤黃酸峰面積的RSD為1.4%表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定.

2.3.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知藤黃酸含量的藤黃提取物樣品6份，分別加入濃度為1.057mg/ml的藤黃酸對照品0.5ml，按制備供試品溶液，分別進樣10μl測定峰面積，計算回收率.回收率為98.76%，RSD=1.69試驗結果表明該試驗的回收率好.

2.3.9 供試品含量測定

將藤黃提取物按2.3.2供試品溶液制備方法制備樣品溶液，精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10μl注入高效液相色譜儀，測定藤黃酸含量.結果見表2.

表2 正交試驗結果表

表3 方差分析表

由方差分析結果可知：中藥藤黃采用乙醇超聲提取，提取次數(shù)、料液比和乙醇濃度有顯著影響；提取時間無顯著影響.影響順序為提取次數(shù)＞料液比＞乙醇濃度＞提取時間.C的影響最小且無顯著性，為節(jié)省時間，提高提取效率，宜選擇C1.綜合考慮確定最佳提取工藝為A2B3C1D3，即以5倍90%乙醇超聲提取3次，每次1小時.

2.4 提取工藝驗證

為進一步考察上述優(yōu)選工藝穩(wěn)定性，對其進行驗證.稱取藤黃粗粉10g，3份，按優(yōu)選工藝條件，即以5倍90%乙醇超聲提取3次，每次1小時.藥材提取物同上述處理方法和檢測方法，計算干浸膏收率和藤黃酸含量.試驗結果見表4.

表4 驗證試驗結果

3 討論

中藥化學成分非常復雜，對其中的所有成分都進行檢測控制是不可能也不必要的.中藥提取效果直接關系到產(chǎn)品的質(zhì)量和療效，所以選擇評價指標在研究工作中就顯得尤為重要，選擇能夠反映該中藥主要藥效的有效成分作為指標對其進行控制，查閱文獻，藤黃酸為藤黃總酸的主要有效成分之一，且在主要成分中含量最高（21.75%-36.59%）[5]；在一定程度上可以代表藤黃總酸質(zhì)量.在藤黃總酸注射液和總藤黃酸親水凝膠骨架片質(zhì)量評價時均選擇藤黃酸含量為評價指標.

本試驗綜合藤黃酸含量和干浸膏得率評價提取工藝.

試驗結果顯示最佳工藝條件為A2B3C1D3，5倍90%乙醇超聲提取3次，每次1小時.為進一步開發(fā)藤黃提供了參考依據(jù).

〔1〕南京醫(yī)學院.藥材學[M].北京:人民衛(wèi)生出版社, 1960.1161.

〔2〕楊企錚,賈淑杰,李德華.中藥藤黃的近代研究[J].中國腫瘤臨床,1994,21(6):464-466.

〔3〕柯仲成，張輝，桂雙英.貫葉金絲桃總黃酮提取工藝研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2009,16(4): 48-50.

〔4〕桂雙英,王舉濤,葉杰勝,等.正交試驗法優(yōu)選桔?？傇碥盏奶崛」に嘯J].安徽中醫(yī)學院學報, 2011,30(5):63-64.

〔5〕江再茂,李遐方,李克，等.高效液相色譜法測定藤黃藥材中藤黃酸[J].中草藥，2008,39(3):445-447.

〔6〕柳文媛,馮鋒,尤啟冬，等.藤黃總酸注射液中藤黃酸的高效液相色譜法測定[J].江蘇藥學與臨床研究,2003,11(1):16-18.

R284.2

A

1673-260X（2013）09-0130-03

亳州職業(yè)技術學院院級課題（BYK201202）；安徽省高校自然科學研究項目2項（No：KJ2010A210）；（No：KJ2012A186）