周瑤，毛淑紅，孫祺，華伯元，王娜，胡曉杰，劉莎，路福平，*

（1.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（天津科技大學(xué)），天津 300457；2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；3.工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；4.天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)，天津 300457）

食用菌是一類營(yíng)養(yǎng)豐富并有很高食用和藥用價(jià)值的大型真菌總稱[1]，它作為一類高蛋白、低脂肪、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高的綠色食品日益受到全世界的重視，并成為保健食品的重要功能因子[2-4]，因此社會(huì)對(duì)食用菌的研究也越來(lái)越深入。食用菌富含多糖、維生素、氨基酸等天然活性成分，其中多糖是一類具有某種特殊生物活性的化合物，具有免疫調(diào)節(jié)功能[5]、抗腫瘤[6]、延緩衰老、降血糖[7]、抗血栓作用等。

茶樹(shù)菇（Agrocybe aegerita）又叫茶薪菇，楊樹(shù)菇，柱狀田頭菇，柳松茸等，屬于真菌界、擔(dān)子菌門、層菌綱、傘菌目、糞銹傘科、田蘑屬，民間曬干后用于頭暈、頭痛、嘔吐及小兒低燒、老人氣喘等癥狀的治療，因此被人們稱為“菇中珍品”，享有“中華神菇”，“神仙菇”之稱?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明,其可滋陰壯陽(yáng)，對(duì)腎虛、尿頻、水腫、癌癥、高血壓、早衰及小兒低熱、尿床等都有較理想的輔助治療功能[8]。茶樹(shù)菇是一種富含多糖的高蛋白﹑低脂肪，礦物質(zhì)含量相對(duì)較高，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高的食用菌。茶樹(shù)菇多糖的提取方法主要包括熱水提取法、超聲波提取法、微波提取法和酶法，水提法雖然簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)，但是多糖的得率較低，超聲波提取法和微波提取法在傳統(tǒng)的方法上多糖提取率有所提升，但是增幅不大，而且對(duì)多糖結(jié)構(gòu)也有一定破壞，酶法技術(shù)具有高效、無(wú)毒、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)[9-10]。本實(shí)驗(yàn)采用兩種復(fù)合酶分步酶解法獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為茶樹(shù)菇的深加工提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，離心分離機(jī)，pH 酸度計(jì)，電熱恒溫水浴鍋，恒溫干燥箱,微量滴定管，電子分析天平，循環(huán)水式多用真空泵，高速組織粉碎機(jī)等。

硫酸為國(guó)產(chǎn)分析純；纖維素酶，木聚糖酶，β-葡聚糖酶，木瓜蛋白酶，果膠酶（天津?yàn)I海諾奧酶工程技術(shù)有限公司，酶活性：≥80 U/mg）；干茶樹(shù)菇子實(shí)體（購(gòu)于市場(chǎng),制成80 目粉末）。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精確稱取干燥恒重葡萄糖100mg，置于100mL容量瓶中用蒸餾水定容，得濃度為1 mg/mL。葡萄糖貯備溶液，再準(zhǔn)確移取20 mL，用蒸餾水定容至100 mL，得0.2 mg/mL 的葡萄糖使用液。

苯酚溶液的配制：苯酚（純苯酚為針狀無(wú)色結(jié)晶），水浴加熱后稱取100 g，加鋁片0.10 g、加入氫氧化鈉0.05 g，蒸餾收集178 ℃～182 ℃的餾分，取餾出液10.0 g，加入水190 mL，得5%的苯酚溶液，置于棕色瓶中備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL 于10 mL 比色管中,分別加入蒸餾水0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3 mL，各加5%的苯酚溶液1 mL 后，再加入濃硫酸5 mL，搖勻放置冷卻，補(bǔ)加蒸餾水到刻度。另取10 mL比色管加入蒸餾水1 mL，加5%的苯酚溶液1 mL，然后加入濃硫酸5mL，按上述方法制得空白溶液，在490nm處測(cè)定吸光度。以糖的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)計(jì)算回歸方程為Y=0.0061x-0.006 6，相關(guān)系數(shù)R=0.998 8。

1.2.2 茶樹(shù)菇多糖的提取及含量測(cè)定

稱取10 g 茶樹(shù)菇粉末，置于100 mL 三角燒瓶中，加入蒸餾水10 mL,分別加入各種濃度的酶，并調(diào)節(jié)初始pH、溫度、反應(yīng)時(shí)間，得到茶樹(shù)菇提取液。加入3 倍體積的乙醇，靜置于4 ℃冰箱24 h；離心（6 000 r/min、10 min），取沉淀，加10 mL 蒸餾水溶解；Sevag 法[11]除蛋白，取上清液，加水稀釋取樣用苯酚硫酸法[12]測(cè)量茶樹(shù)菇多糖的含量。

1.2.3 利用復(fù)合生物酶制劑分步制取茶樹(shù)菇水解液的工藝

2 結(jié)果與分析

2.1 一次酶解過(guò)程中水解茶樹(shù)菇條件的確定

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)

采用單因素試驗(yàn)確定酶濃度，水解時(shí)間，初始pH，水解溫度以及料液比對(duì)茶樹(shù)菇的水解程度，并測(cè)定其水解液中多糖的含量，以此選擇復(fù)合酶水解試驗(yàn)的條件依據(jù)。

2.1.1.1 酶添加量對(duì)茶樹(shù)菇水解影響

每組稱取茶樹(shù)菇子實(shí)體粉末10 g，料液比1∶10（g/mL），溫度50 ℃，在初始pH 為4.5 時(shí)分別加入不同的酶，纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶，添加量分別0.05%，0.10%，0.15%，0.20%，0.25%，酶解2 h，升溫滅酶，檢測(cè)水解液中多糖含量，酶添加量對(duì)茶樹(shù)菇水解液中多糖含量的影響如圖1 所示。

圖1 酶添加量對(duì)茶樹(shù)菇水解液中多糖含量的影響Fig.1 Enzyme concentration for influence of polysaccharide amount in A.aegirit hydrolysate

如圖1 所示，隨著酶添加量的增加茶樹(shù)菇水解液中的多糖含量也隨著增加，當(dāng)酶添加量增加到0.15%時(shí)茶樹(shù)菇水解液中的多糖含量也達(dá)到峰值，再增加酶添加量茶樹(shù)菇水解液中的含量也沒(méi)有明顯增加。

2.1.1.2 初始pH 對(duì)茶樹(shù)菇水解液的影響

每組稱取茶樹(shù)菇子實(shí)體粉末10 g，料液比1∶10（g/mL），溫度50 ℃，在初始pH 為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 時(shí)分別加入纖維素0.15%，木聚糖酶0.15%，β-葡聚糖酶0.20%，進(jìn)行酶解，酶解2 h，升溫滅酶，檢測(cè)水解液中多糖含量，pH 對(duì)茶樹(shù)菇水解液中多糖含量的影響如圖2 所示。

圖2 pH 對(duì)茶樹(shù)菇水解液中多糖含量的影響Fig.2 pH for influence of polysaccharide amount in A.aegirit hydrolysate

如圖2 所示，隨著pH 變大茶樹(shù)菇水解液中的多糖含量也隨著增加，當(dāng)pH 達(dá)到4.5～5 時(shí)茶樹(shù)菇水解液中的多糖含量也達(dá)到峰值，之后再增大pH 茶樹(shù)菇水解液中的多糖含量逐漸降低。

2.1.1.3 酶解時(shí)間對(duì)茶樹(shù)菇水解液的影響

每組稱取茶樹(shù)菇子實(shí)體粉末10 g，料液比1∶10（g/mL），在溫度50 ℃時(shí)分別加入纖維素酶0.15%，木聚糖酶0.15%，β-葡聚糖酶0.20%，進(jìn)行酶解，在初始pH 為4.5 時(shí)，分別酶解1、2、3、4、5 h，升溫滅酶，檢測(cè)水解液中多糖含量，酶解時(shí)間對(duì)茶樹(shù)菇水解液中多糖含量的影響如圖3 所示。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)茶樹(shù)菇水解液中多糖含量的影響Fig.3 Time for influence of polysaccharide amount in A.aegirit hydrolysate

如圖3 所示，隨著酶解時(shí)間的增長(zhǎng)茶樹(shù)菇水解液中的多糖含量也隨著增加，當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到3 h 時(shí)茶樹(shù)菇水解液中的多糖含量也達(dá)到峰值，再延長(zhǎng)酶解時(shí)間茶樹(shù)菇水解液中的含量也沒(méi)有明顯增加。

2.1.1.4 酶解溫度對(duì)茶樹(shù)菇水解液的影響

每組稱取茶樹(shù)菇子實(shí)體粉末10 g，料液比1∶10（g/mL），在40、45、50、55、60 ℃不同溫度時(shí)，分別加入纖維素酶0.15%，木聚糖酶0.15%，β-葡聚糖酶0.20%，進(jìn)行酶解，在初始pH 為4.5 時(shí)酶解2 h，升溫滅酶，檢測(cè)水解液中多糖含量，酶解溫度對(duì)茶樹(shù)菇水解液中多糖含量的影響如圖4 所示。

圖4 酶解溫度對(duì)茶樹(shù)菇水解液中多糖含量的影響Fig.4 Temperature for influence of polysaccharide amount in A.aegirit hydrolysate

如圖4 所示，隨著酶解溫度增加茶樹(shù)菇水解液中的多糖含量也隨著增加，當(dāng)酶解溫度達(dá)到45 ℃～50 ℃時(shí)茶樹(shù)菇水解液中的多糖含量也達(dá)到峰值，之后再增加酶解溫度茶樹(shù)菇水解液中的多糖含量逐漸降低。

2.1.1.5 料液比對(duì)茶樹(shù)菇水解液的影響

每組稱取茶樹(shù)菇子實(shí)體粉末10 g，在溫度50 ℃時(shí)分別加入纖維素酶0.15%，木聚糖酶0.15%，β-葡聚糖酶0.20%，在初始pH 為4.5 時(shí)，酶解2 h，分別選擇料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50（g/mL），升溫滅酶，檢測(cè)水解液中多糖含量，料液比對(duì)茶樹(shù)菇水解液中多糖含量的影響如圖5 所示。

圖5 料液比對(duì)茶樹(shù)菇水解液中多糖含量的影響Fig.5 Material/liquid ratio for influence of polysaccharide amount in A.aegirit hydrolysate

如圖5 所示，隨著料液比增加茶樹(shù)菇水解液中的多糖含量也隨著增加，當(dāng)料液比達(dá)到1∶20（g/mL）時(shí)茶樹(shù)菇水解液中的多糖含量也達(dá)到峰值，之后再增大料液比值茶樹(shù)菇水解液中的多糖含量逐漸降低。

2.1.2 復(fù)合酶I 的正交試驗(yàn)

由于茶樹(shù)菇的細(xì)胞壁是由蛋白質(zhì)、幾丁質(zhì)、纖維素組成，較堅(jiān)固，為了更好地使是蛋白質(zhì)和多糖等溶出，又不使成本過(guò)高，采用纖維素酶，β-葡聚糖酶和木聚糖酶共同作用，以提高茶樹(shù)菇細(xì)胞壁的破碎率。

在使用纖維素酶，木聚糖酶，β-葡聚糖酶共同作用時(shí)，由于通過(guò)單因素試驗(yàn)可知纖維素酶，木聚糖酶，β-葡聚糖酶的最佳作用濃度分別為0.15%，0.15%及0.20%，我們以前兩者用量為0.15%作為基準(zhǔn)，后者分別以0.15%，0.20%，0.25%，0.30%與之進(jìn)行復(fù)配，在單酶試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，同時(shí)又考慮了復(fù)合酶I 的水解初始pH，水解時(shí)間和水解溫度的影響，選用L16（54）進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素水平如表1。以水解液中多糖含量為考察指標(biāo)，分析試驗(yàn)結(jié)果，確定復(fù)合酶I 水解茶樹(shù)菇的最適條件。

表1 復(fù)合酶I 正交試驗(yàn)L16（54）因素與水平Table 1 the orthogonal experiments of Composite enzyme I factors and level

由表1 可知，各因素的主次順序依次是A、C、B、D、E，最佳的水平條件組合為A4B2C3D2E2。通過(guò)正交試驗(yàn)得到復(fù)合酶I 提取茶樹(shù)菇多糖的最佳工藝條件為：纖維素酶∶木聚糖酶∶β-葡聚糖酶=3∶3∶6，pH 為5.0，酶解時(shí)間2 h，酶解溫度50 ℃，料液比為1∶20（g/mL）。在此條件下茶樹(shù)菇水解液中的多糖含量為197.65 mg/g。

2.2 二次酶解水解茶樹(shù)菇條件的確定

在使用木瓜蛋白酶，果膠酶共同作用時(shí)，以前者用量為0.20%作為基準(zhǔn)，后者分別以0.15%、0.20%、0.25%、0.30%的添加量與之合用，在單酶實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，同時(shí)又考慮了復(fù)合酶II 的水解初始pH，水解時(shí)間和水解溫度的影響。以水解液中多糖含量為考察指標(biāo)，分析試驗(yàn)結(jié)果，確定復(fù)合酶II 水解茶樹(shù)菇提取多糖的最適條件。

通過(guò)正交試驗(yàn)得到復(fù)合酶II 提取茶樹(shù)菇多糖的最佳工藝條件為：木瓜蛋白酶∶果膠酶=4∶6，酶解溫度55 ℃，酶解時(shí)間2 h，pH 為4.0，料液比為1∶40（g/mL）。在此條件下茶樹(shù)菇水解液中的多糖含量為201.86mg/g。

3 結(jié)論

采用兩種復(fù)合酶制劑進(jìn)行茶樹(shù)菇多糖的提取，通過(guò)正交試驗(yàn)篩選出了復(fù)合酶制劑的最佳組合：一次酶解的最優(yōu)條件為纖維素酶：木聚糖酶：β-葡聚糖酶=3∶3∶6，pH 為5.0，酶解時(shí)間2 h，酶解溫度50 ℃，料液比為1∶20（g/mL）。二次酶解的最優(yōu)條件為木瓜蛋白酶∶果膠酶=4∶6，酶解溫度55 ℃，酶解時(shí)間2 h，pH 為4.0，料液比為1∶40。此次實(shí)驗(yàn)，我們采用的復(fù)合酶制劑分步水解的方法與其它實(shí)驗(yàn)相比，可以明顯提高多糖的提取率，多糖含量較其它也有顯著升高。比較一二次酶解效果，經(jīng)過(guò)二次酶解后多糖含量比一次酶解后的多糖含量沒(méi)有明顯的增加，說(shuō)明二次酶解并沒(méi)有使多糖物質(zhì)更多的釋放，但是經(jīng)過(guò)二次酶解后其它的生物活性物質(zhì)（如：α-氨基氮等）較一次酶解后都有大幅度的提升。從經(jīng)濟(jì)利益方面考慮，最終確定茶樹(shù)菇提取多糖的復(fù)合酶制劑配方為一次酶解的最優(yōu)條件，即纖維素酶：木聚糖酶：β-葡聚糖酶=3∶3∶6，pH 為5.0，酶解時(shí)間2 h，酶解溫度50℃，料液比為1∶20（g/mL）。

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