王瑩，屈玉霄，劉春紅，馮志彪，*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學理學院應用化學系，黑龍江 哈爾濱 150030）

乳清蛋白是牛奶中的一種主要蛋白質(zhì)，β-乳球蛋白（β-l g）和α-乳白蛋白（α-la）是其主要成分，分別占其總量的40%～50%和10%～20%。β-牛乳球蛋白包括β-Lg A 和β-Lg B 兩個遺傳變異體[1-2]。隨著人們生活水平的提高，奶制品在中國的消費量增加迅速。但嬰幼兒中牛乳蛋白過敏癥（cow′milk allergy，CMA）的發(fā)生較為普遍，并且呈逐年上升趨勢[3]，嬰幼兒主要是對β-乳球蛋白和α-乳白蛋白過敏，而酪蛋白則在成人持續(xù)性過敏中占主導地位[4]，因此，建立牛乳β-乳球蛋白和α-乳白蛋白高特異性、高靈敏度、快速、準確的檢測方法，將對維護CMA 患兒的健康起到積極的作用。

目前，實驗室中經(jīng)常用檢測α-la 和β-lg 的方法主要有：聚丙烯凝膠電泳[5-6]、色譜和電泳法[7]、毛細管電泳[8-10]、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）[11]等。但以上各種方法在測定α-乳白蛋白時都有一定的局限性，液相色譜法是分析乳清蛋白成分的有效方法之一，具有分辨率和回收率高、重復性好、操作簡便等優(yōu)勢。目前，反相高效液相色譜分析乳清蛋白在國內(nèi)外已經(jīng)進行了一定的研究[12-16]。但是國內(nèi)對市售α-乳白蛋白樣品的分析罕見報道。

采用C8色譜柱，優(yōu)化了α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的分析條件，與現(xiàn)有的方法相比縮短了分析時間、簡化了洗脫條件，而且鑒別出β-Lg A 和β-Lg B 兩種異構(gòu)體，將建立的定量測定兩種蛋白質(zhì)的方法為監(jiān)測目前市場中各類乳清蛋白粉保健品及低過敏乳制品的質(zhì)量提供了有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

α-乳白蛋白標準品、β-乳球蛋白標準品：美國Sigma 公司；乙腈：色譜純；三氟乙酸（TFA）：色譜純，美國TEDIA 公司；高效液相色譜儀（Waters1525 型）、二級管陣列檢測器（Waters 2998）、自動進樣器（Waters 2707）：美國Waters 公司；色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）：Agilent-C8，美國安捷倫公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件

流動相：流動相（A）為乙腈+三氟乙酸（1 000∶0.5），流動相（B）為含0.1%三氟乙酸的超純水；梯度洗脫程序：流動相A 在15 min 內(nèi)從30%上升到50%，然后用2 min 從50%降到30%，流速1 mL/min，柱溫25 ℃；檢測波長：280 nm；進樣量：10 μL。

1.2.2 對照品溶液的制備

精確稱取α-乳白蛋白及β-乳球蛋白標準品10 mg，用超純水配制成2 mg/mL 的原液，上述溶液均作為標準儲備液，保存于4 ℃冰箱中備用。

1.2.3 樣品溶液的制備

5 種樣品標注信息見表1。

表1 5 種樣品信息Table 1 The information of samples used

采用凱氏定氮法測定各樣品中的蛋白質(zhì)含量。

分別精確稱取5 種樣品各40 mg，用去離子水定容至10 mL 備用。

樣品在上樣前均用孔徑為0.22 μm 的針式濾器過濾。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相的選擇

α-乳白蛋白屬于溶菌酶家族的蛋白，含有123 個氨基酸殘基，分子量為14.2 ku。α-乳白蛋白有N 型構(gòu)象（天然構(gòu)象）和A 型構(gòu)象（酸構(gòu)象），在乳的正常pH（pH6.6～6.8）時，呈N 型構(gòu)象；當pH＜5 時，N 型構(gòu)象向A 型構(gòu)象轉(zhuǎn)移。此外，升高溫度、堿性pH、添加低濃度變性劑、Ca2+的去除和一定金屬離子如Zn2+的添加會引起構(gòu)象的此類轉(zhuǎn)化[17]。β-乳球蛋白屬于lipocalin 蛋白家族，其單體由162 個氨基酸殘基組成[18]，分子量18.3 ku，等電點5.3。其存在形式與pH 有關(guān)，在鮮牛乳中pH（6.6～6.8），它是以二聚體的形式存在，當pH 低于3.5 時，二聚體離解成單體，pH 在3.5～5.2 之間時，二聚體四聚化形成八聚體，pH 高于7.5 時，二聚體解離且構(gòu)象發(fā)生變化形成膨脹的單體[19]。根據(jù)α-乳白蛋白和β-乳球蛋白結(jié)構(gòu)，本實驗選用了上述Agilent C8色譜柱。本文采用C8柱分離，目標物出峰時間短，峰形尖銳而且對稱，分離度較好，可以滿足β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的分析要求。

采用反相高效液相色譜方法分析蛋白的流動相系統(tǒng)基本為三氟乙酸的水溶液和乙腈溶液，采用梯度洗脫，但隨著樣品的不同及色譜柱的不同，梯度洗脫條件也隨之改變。在蛋白質(zhì)的反相液相色譜分離中，初始洗脫條件下流動相中有機溶劑的濃度較低，蛋白質(zhì)與固定相間的疏水作用較強，蛋白質(zhì)幾乎完全被固定相吸附。而一旦流動相中的有機溶劑達到特定的濃度，使蛋白質(zhì)與固定相的作用小于與流動相的作用時，蛋白質(zhì)就會完全從固定相上洗脫下來，幾乎不再與固定相發(fā)生作用。本試驗嘗試了以不同比例的三氟乙酸的水溶液和乙腈溶液作流動相。當以高比例的水進行梯度洗脫時，蛋白質(zhì)的出峰時間延遲；而以高比例的乙腈進行梯度洗脫時，多肽及蛋白質(zhì)的出峰時間縮短，但α-乳白蛋白和β-乳球蛋白不能分開。在兼顧保留時間和分離度的前提下，最終選擇用于測定α-乳白蛋白的流動相及梯度洗脫條件如“1.2.1”節(jié)所述。標準品和樣品的分離結(jié)果分別見圖1、圖2 和圖3。

圖1 α-乳白蛋白和β-乳球蛋白標樣的色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of standard protein reference

圖2 WPI 的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of WPI

圖3 市售α-乳白蛋白的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of commercial available α-la

由圖2、圖3 可以看出，WPI 中β-乳球蛋白占主要部分，而α-乳白蛋白含量相對較少，市售α-乳白蛋白樣品中，α-乳白蛋白的含量相對較高，國內(nèi)對這種市售α-乳白蛋白研究較少，如進一步對其研究將具有十分重要的意義。

2.2 線性相關(guān)性及檢出限

按1.2.1 所述色譜條件進行測定，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標做標準曲線，以信噪比S/N=3 測定α-乳白蛋白和β-乳球蛋白最小檢出限，結(jié)果見表2。

表2 兩種乳清蛋白的線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢測限Table 2 Linear equations，correlation coefficients and detection limit of α-la and β-lg

由表2 還可看出，兩組分在測定的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 方法的穩(wěn)定性及重現(xiàn)性

將配制好的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白標準溶液在室溫下保存24 h 后，按1.2.1 所述色譜條件，每樣平行測定5 次，測定α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量的相對標準偏差（RSD）分別為1.7%和2.3%。表明24 h內(nèi)對上述兩種標準品的檢測符合要求。

精密稱取待測樣品1 各3 份，溶解定容后用針式濾器過濾處理，分別進樣10 μL，按照外標法測定其中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的含量，并計算其RSD分別為2.1%和3.1%表明該法重現(xiàn)性良好。

2.4 加樣回收率實驗

取樣品2 和樣品3 各3 份，分別加入一定量的標準品混合溶液，用0.22 μm 的針式濾器過濾后進樣測定，結(jié)果見表3。

表3 回收率測定結(jié)果（n=3）Table 3 Determination results of recovery（n=3）

由表3 可以看出，兩種樣品回收率均大于92.0%，測定標準偏差均小于5%，符合實驗要求。

2.5 樣品的測定結(jié)果

取一定量的樣品按1.2.3 樣品處理方法及1.2.1 色譜條件進行測定，樣品色譜圖見圖2 和圖3。由圖2、圖3 可知，樣品中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的出峰時間與其標準品的出峰時間一致，色譜分離效果很好。由于α-乳白蛋白有N 型構(gòu)象（天然構(gòu)象）和A 型構(gòu)象（酸構(gòu)象），所以α-乳白蛋白的樣品具有兩個峰。說明該方法能有效的檢測出的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白。通過外標法測得樣品中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的含量及在樣品蛋白質(zhì)中所占的比例，結(jié)果見表4。

表4 樣品測定結(jié)果Table 4 Determination results of sample

根據(jù)表4 可以看出，該方法可以用于檢測奶粉樣品中兩種蛋白的含量，能夠快速檢測嬰幼兒配方食品中α-乳白蛋白及β-乳球蛋白含量。

3 結(jié)論

利用C8色譜柱，采用HPLC 法測定牛乳中主要過敏蛋白α-乳白蛋白及β-乳球蛋白的含量，其測定條件為：Agilent-C8（4.6 mm×150 mm，5 μm）色譜柱，流動相A 為含0.5%三氟乙酸的乙腈，流動相B 為含0.1%三氟乙酸的超純水，采用梯度洗脫方法，柱溫25 ℃，流速1 mL/min，進樣量10 μL，檢測波長280 nm，外標法定量。在該條件下樣品中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白分離度較好，出峰時間適中。

用本法測定牛乳中的主要過敏蛋白α-乳白蛋白和β-乳球蛋白，簡便易行、準確靈敏，可為乳制品的質(zhì)量評價及生產(chǎn)工藝控制提供依據(jù)。

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