王瑩,屈玉霄,劉春紅,馮志彪,*
(1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院,黑龍江 哈爾濱 150030;2.東北農(nóng)業(yè)大學理學院應用化學系,黑龍江 哈爾濱 150030)
乳清蛋白是牛奶中的一種主要蛋白質(zhì),β-乳球蛋白(β-l g)和α-乳白蛋白(α-la)是其主要成分,分別占其總量的40%~50%和10%~20%。β-牛乳球蛋白包括β-Lg A 和β-Lg B 兩個遺傳變異體[1-2]。隨著人們生活水平的提高,奶制品在中國的消費量增加迅速。但嬰幼兒中牛乳蛋白過敏癥(cow′milk allergy,CMA)的發(fā)生較為普遍,并且呈逐年上升趨勢[3],嬰幼兒主要是對β-乳球蛋白和α-乳白蛋白過敏,而酪蛋白則在成人持續(xù)性過敏中占主導地位[4],因此,建立牛乳β-乳球蛋白和α-乳白蛋白高特異性、高靈敏度、快速、準確的檢測方法,將對維護CMA 患兒的健康起到積極的作用。
目前,實驗室中經(jīng)常用檢測α-la 和β-lg 的方法主要有:聚丙烯凝膠電泳[5-6]、色譜和電泳法[7]、毛細管電泳[8-10]、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)[11]等。但以上各種方法在測定α-乳白蛋白時都有一定的局限性,液相色譜法是分析乳清蛋白成分的有效方法之一,具有分辨率和回收率高、重復性好、操作簡便等優(yōu)勢。目前,反相高效液相色譜分析乳清蛋白在國內(nèi)外已經(jīng)進行了一定的研究[12-16]。但是國內(nèi)對市售α-乳白蛋白樣品的分析罕見報道。
采用C8色譜柱,優(yōu)化了α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的分析條件,與現(xiàn)有的方法相比縮短了分析時間、簡化了洗脫條件,而且鑒別出β-Lg A 和β-Lg B 兩種異構(gòu)體,將建立的定量測定兩種蛋白質(zhì)的方法為監(jiān)測目前市場中各類乳清蛋白粉保健品及低過敏乳制品的質(zhì)量提供了有效的方法。
α-乳白蛋白標準品、β-乳球蛋白標準品:美國Sigma 公司;乙腈:色譜純;三氟乙酸(TFA):色譜純,美國TEDIA 公司;高效液相色譜儀(Waters1525 型)、二級管陣列檢測器(Waters 2998)、自動進樣器(Waters 2707):美國Waters 公司;色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm):Agilent-C8,美國安捷倫公司。
1.2.1 色譜條件
流動相:流動相(A)為乙腈+三氟乙酸(1 000∶0.5),流動相(B)為含0.1%三氟乙酸的超純水;梯度洗脫程序:流動相A 在15 min 內(nèi)從30%上升到50%,然后用2 min 從50%降到30%,流速1 mL/min,柱溫25 ℃;檢測波長:280 nm;進樣量:10 μL。
1.2.2 對照品溶液的制備
精確稱取α-乳白蛋白及β-乳球蛋白標準品10 mg,用超純水配制成2 mg/mL 的原液,上述溶液均作為標準儲備液,保存于4 ℃冰箱中備用。
1.2.3 樣品溶液的制備
5 種樣品標注信息見表1。
表1 5 種樣品信息Table 1 The information of samples used
采用凱氏定氮法測定各樣品中的蛋白質(zhì)含量。
分別精確稱取5 種樣品各40 mg,用去離子水定容至10 mL 備用。
樣品在上樣前均用孔徑為0.22 μm 的針式濾器過濾。
α-乳白蛋白屬于溶菌酶家族的蛋白,含有123 個氨基酸殘基,分子量為14.2 ku。α-乳白蛋白有N 型構(gòu)象(天然構(gòu)象)和A 型構(gòu)象(酸構(gòu)象),在乳的正常pH(pH6.6~6.8)時,呈N 型構(gòu)象;當pH<5 時,N 型構(gòu)象向A 型構(gòu)象轉(zhuǎn)移。此外,升高溫度、堿性pH、添加低濃度變性劑、Ca2+的去除和一定金屬離子如Zn2+的添加會引起構(gòu)象的此類轉(zhuǎn)化[17]。β-乳球蛋白屬于lipocalin 蛋白家族,其單體由162 個氨基酸殘基組成[18],分子量18.3 ku,等電點5.3。其存在形式與pH 有關(guān),在鮮牛乳中pH(6.6~6.8),它是以二聚體的形式存在,當pH 低于3.5 時,二聚體離解成單體,pH 在3.5~5.2 之間時,二聚體四聚化形成八聚體,pH 高于7.5 時,二聚體解離且構(gòu)象發(fā)生變化形成膨脹的單體[19]。根據(jù)α-乳白蛋白和β-乳球蛋白結(jié)構(gòu),本實驗選用了上述Agilent C8色譜柱。本文采用C8柱分離,目標物出峰時間短,峰形尖銳而且對稱,分離度較好,可以滿足β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的分析要求。
采用反相高效液相色譜方法分析蛋白的流動相系統(tǒng)基本為三氟乙酸的水溶液和乙腈溶液,采用梯度洗脫,但隨著樣品的不同及色譜柱的不同,梯度洗脫條件也隨之改變。在蛋白質(zhì)的反相液相色譜分離中,初始洗脫條件下流動相中有機溶劑的濃度較低,蛋白質(zhì)與固定相間的疏水作用較強,蛋白質(zhì)幾乎完全被固定相吸附。而一旦流動相中的有機溶劑達到特定的濃度,使蛋白質(zhì)與固定相的作用小于與流動相的作用時,蛋白質(zhì)就會完全從固定相上洗脫下來,幾乎不再與固定相發(fā)生作用。本試驗嘗試了以不同比例的三氟乙酸的水溶液和乙腈溶液作流動相。當以高比例的水進行梯度洗脫時,蛋白質(zhì)的出峰時間延遲;而以高比例的乙腈進行梯度洗脫時,多肽及蛋白質(zhì)的出峰時間縮短,但α-乳白蛋白和β-乳球蛋白不能分開。在兼顧保留時間和分離度的前提下,最終選擇用于測定α-乳白蛋白的流動相及梯度洗脫條件如“1.2.1”節(jié)所述。標準品和樣品的分離結(jié)果分別見圖1、圖2 和圖3。
圖1 α-乳白蛋白和β-乳球蛋白標樣的色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of standard protein reference
圖2 WPI 的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of WPI
圖3 市售α-乳白蛋白的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of commercial available α-la
由圖2、圖3 可以看出,WPI 中β-乳球蛋白占主要部分,而α-乳白蛋白含量相對較少,市售α-乳白蛋白樣品中,α-乳白蛋白的含量相對較高,國內(nèi)對這種市售α-乳白蛋白研究較少,如進一步對其研究將具有十分重要的意義。
按1.2.1 所述色譜條件進行測定,以峰面積為縱坐標,濃度為橫坐標做標準曲線,以信噪比S/N=3 測定α-乳白蛋白和β-乳球蛋白最小檢出限,結(jié)果見表2。
表2 兩種乳清蛋白的線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢測限Table 2 Linear equations,correlation coefficients and detection limit of α-la and β-lg
由表2 還可看出,兩組分在測定的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
將配制好的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白標準溶液在室溫下保存24 h 后,按1.2.1 所述色譜條件,每樣平行測定5 次,測定α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量的相對標準偏差(RSD)分別為1.7%和2.3%。表明24 h內(nèi)對上述兩種標準品的檢測符合要求。
精密稱取待測樣品1 各3 份,溶解定容后用針式濾器過濾處理,分別進樣10 μL,按照外標法測定其中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的含量,并計算其RSD分別為2.1%和3.1%表明該法重現(xiàn)性良好。
取樣品2 和樣品3 各3 份,分別加入一定量的標準品混合溶液,用0.22 μm 的針式濾器過濾后進樣測定,結(jié)果見表3。
表3 回收率測定結(jié)果(n=3)Table 3 Determination results of recovery(n=3)
由表3 可以看出,兩種樣品回收率均大于92.0%,測定標準偏差均小于5%,符合實驗要求。
取一定量的樣品按1.2.3 樣品處理方法及1.2.1 色譜條件進行測定,樣品色譜圖見圖2 和圖3。由圖2、圖3 可知,樣品中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的出峰時間與其標準品的出峰時間一致,色譜分離效果很好。由于α-乳白蛋白有N 型構(gòu)象(天然構(gòu)象)和A 型構(gòu)象(酸構(gòu)象),所以α-乳白蛋白的樣品具有兩個峰。說明該方法能有效的檢測出的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白。通過外標法測得樣品中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的含量及在樣品蛋白質(zhì)中所占的比例,結(jié)果見表4。
表4 樣品測定結(jié)果Table 4 Determination results of sample
根據(jù)表4 可以看出,該方法可以用于檢測奶粉樣品中兩種蛋白的含量,能夠快速檢測嬰幼兒配方食品中α-乳白蛋白及β-乳球蛋白含量。
利用C8色譜柱,采用HPLC 法測定牛乳中主要過敏蛋白α-乳白蛋白及β-乳球蛋白的含量,其測定條件為:Agilent-C8(4.6 mm×150 mm,5 μm)色譜柱,流動相A 為含0.5%三氟乙酸的乙腈,流動相B 為含0.1%三氟乙酸的超純水,采用梯度洗脫方法,柱溫25 ℃,流速1 mL/min,進樣量10 μL,檢測波長280 nm,外標法定量。在該條件下樣品中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白分離度較好,出峰時間適中。
用本法測定牛乳中的主要過敏蛋白α-乳白蛋白和β-乳球蛋白,簡便易行、準確靈敏,可為乳制品的質(zhì)量評價及生產(chǎn)工藝控制提供依據(jù)。
[1]管斌,林洪,王廣策.食品蛋白質(zhì)化學[M].北京:化學工業(yè)出版社,2005:303
[2]Kinghorn N M,Norris C S,Paterson G R,et al.Comparison of capillary electrophoresis with traditional methods to analysis bovine whey proteins[J].Chromatogr A,1995,700:111-123
[3]Gareia-Ara M C,Boyano-Martínez MT,Díaz-Pena J M,et al.Cow′s milk-specific immunoglobulin E levels as predictors of clinical reactivity in the follow-up of the cow′s milk allergy infants[J].Clin Ex P Allergy,2004,34(6):866-87
[4]DelaReguera C.Systematie review and modelling of the investigation of aeute and chronie cow′s milk allergy [J].Arch Inst Cardiol,1978,48(5):979-994
[5]Alban A,David S O,Bjorkesten L,et al.A novel experimental design for comparative two-dimensional gel analysis:two-dimensional difference gel electrophoresis incorporating a pooled internal standard[J].Proteomics,2003(3):36-44
[6]Rehder-Silinski MA,McGown LB.Capillary electrochromatographic separation of bovine milk proteins using a G-quartet DNA stationary phase[J].J Chromatogr A,2003,1008:233-245
[7]Strange E D,Malin E L,Van Hekken D L,et al.Chromatographic and electrophoretic methods used for analysis of milk proteins[J].Journal of Chromatography A,1992,624:81-102
[8]De Jong N,Visser S,Olieman C.Determination of milk proteins by capillary electrophoresis[J].J Chromatogr A,1993(652):207-213
[9]Visser S,Slangen CJ,Rollema HS.Phenotyping of bovine milk proteins by reversed-phase high-performance liquid chromatography[J].J Chromatogr A,1991,548:361-370
[10]Xiao jing Ding etal.Analysis of α-lactalbumin,β-lactoglobulin A and B in whey protein powder,colostrum,raw milk,and infant formula by CE and LC[J].Dairy Sci&Technol,2011,91:213-225
[11]張中華.牛乳α-乳白蛋白和β-乳球蛋白間接競爭ELISA 檢測方法的建立[D].昆明醫(yī)學院,2009
[12]李慧,陳敏,李赫,等.反相高效液相色譜法測定乳清蛋白中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白[J].色譜,2007,125(1):116-117
[13]Mercier A,Gauthier S F,Fliss I.Immunomodulating effects of whey proteins and their enzymatic digests [J].Int Dairy J,2004,14(3):175-183
[14]Mota M,Ferreira I,O liveira M,et al.Enzymatic hydrolysis of whey protein concentrate:peptide HPLC profile [J].Journal of Liquid Chromatography&Related Technologies,2004,27(16):2625-2639
[15]M iddleton N,Reid J R,Coolbear T,et al.Proliferation and intracellular glutathione in Jurkat T cells with concentrated whey protein products[J].Int Dairy J,2003,13(7):565-573
[16]Sharma R,Zakora M,Qvist K.Susceptibility of an industrial alpha lactalbumin concentrate to cross linking by microbial transglutaminase[J].Int Dairy J,2002,12(12):1005-1012
[17]趙維新,于國萍,張永忠,等.乳品化學[M].科學出版社,2007:88-118
[18]Braunitzer G,Chen R,Schrank B,et al.The sequence of beta-lactoglobulin (author's transl)[J].HoPPe Seylers Z PHysiol Chem,1973,354(8):867-878
[19]Brownlow S,Morais Cabral JH,Cooper R,et al.Bovine beta-lactoglobulin at 1.8 A resolution-still an enigmatic lipocalin[J].Structure,1997,5(4):481-495