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        高效液相色譜法測定α-乳白蛋白和β-乳球蛋白

        2013-07-12 09:57:04王瑩屈玉霄劉春紅馮志彪
        食品研究與開發(fā) 2013年2期
        關(guān)鍵詞:三氟乙酸構(gòu)象白蛋白

        王瑩,屈玉霄,劉春紅,馮志彪,*

        (1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院,黑龍江 哈爾濱 150030;2.東北農(nóng)業(yè)大學理學院應用化學系,黑龍江 哈爾濱 150030)

        乳清蛋白是牛奶中的一種主要蛋白質(zhì),β-乳球蛋白(β-l g)和α-乳白蛋白(α-la)是其主要成分,分別占其總量的40%~50%和10%~20%。β-牛乳球蛋白包括β-Lg A 和β-Lg B 兩個遺傳變異體[1-2]。隨著人們生活水平的提高,奶制品在中國的消費量增加迅速。但嬰幼兒中牛乳蛋白過敏癥(cow′milk allergy,CMA)的發(fā)生較為普遍,并且呈逐年上升趨勢[3],嬰幼兒主要是對β-乳球蛋白和α-乳白蛋白過敏,而酪蛋白則在成人持續(xù)性過敏中占主導地位[4],因此,建立牛乳β-乳球蛋白和α-乳白蛋白高特異性、高靈敏度、快速、準確的檢測方法,將對維護CMA 患兒的健康起到積極的作用。

        目前,實驗室中經(jīng)常用檢測α-la 和β-lg 的方法主要有:聚丙烯凝膠電泳[5-6]、色譜和電泳法[7]、毛細管電泳[8-10]、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)[11]等。但以上各種方法在測定α-乳白蛋白時都有一定的局限性,液相色譜法是分析乳清蛋白成分的有效方法之一,具有分辨率和回收率高、重復性好、操作簡便等優(yōu)勢。目前,反相高效液相色譜分析乳清蛋白在國內(nèi)外已經(jīng)進行了一定的研究[12-16]。但是國內(nèi)對市售α-乳白蛋白樣品的分析罕見報道。

        采用C8色譜柱,優(yōu)化了α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的分析條件,與現(xiàn)有的方法相比縮短了分析時間、簡化了洗脫條件,而且鑒別出β-Lg A 和β-Lg B 兩種異構(gòu)體,將建立的定量測定兩種蛋白質(zhì)的方法為監(jiān)測目前市場中各類乳清蛋白粉保健品及低過敏乳制品的質(zhì)量提供了有效的方法。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        α-乳白蛋白標準品、β-乳球蛋白標準品:美國Sigma 公司;乙腈:色譜純;三氟乙酸(TFA):色譜純,美國TEDIA 公司;高效液相色譜儀(Waters1525 型)、二級管陣列檢測器(Waters 2998)、自動進樣器(Waters 2707):美國Waters 公司;色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm):Agilent-C8,美國安捷倫公司。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 色譜條件

        流動相:流動相(A)為乙腈+三氟乙酸(1 000∶0.5),流動相(B)為含0.1%三氟乙酸的超純水;梯度洗脫程序:流動相A 在15 min 內(nèi)從30%上升到50%,然后用2 min 從50%降到30%,流速1 mL/min,柱溫25 ℃;檢測波長:280 nm;進樣量:10 μL。

        1.2.2 對照品溶液的制備

        精確稱取α-乳白蛋白及β-乳球蛋白標準品10 mg,用超純水配制成2 mg/mL 的原液,上述溶液均作為標準儲備液,保存于4 ℃冰箱中備用。

        1.2.3 樣品溶液的制備

        5 種樣品標注信息見表1。

        表1 5 種樣品信息Table 1 The information of samples used

        采用凱氏定氮法測定各樣品中的蛋白質(zhì)含量。

        分別精確稱取5 種樣品各40 mg,用去離子水定容至10 mL 備用。

        樣品在上樣前均用孔徑為0.22 μm 的針式濾器過濾。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 流動相的選擇

        α-乳白蛋白屬于溶菌酶家族的蛋白,含有123 個氨基酸殘基,分子量為14.2 ku。α-乳白蛋白有N 型構(gòu)象(天然構(gòu)象)和A 型構(gòu)象(酸構(gòu)象),在乳的正常pH(pH6.6~6.8)時,呈N 型構(gòu)象;當pH<5 時,N 型構(gòu)象向A 型構(gòu)象轉(zhuǎn)移。此外,升高溫度、堿性pH、添加低濃度變性劑、Ca2+的去除和一定金屬離子如Zn2+的添加會引起構(gòu)象的此類轉(zhuǎn)化[17]。β-乳球蛋白屬于lipocalin 蛋白家族,其單體由162 個氨基酸殘基組成[18],分子量18.3 ku,等電點5.3。其存在形式與pH 有關(guān),在鮮牛乳中pH(6.6~6.8),它是以二聚體的形式存在,當pH 低于3.5 時,二聚體離解成單體,pH 在3.5~5.2 之間時,二聚體四聚化形成八聚體,pH 高于7.5 時,二聚體解離且構(gòu)象發(fā)生變化形成膨脹的單體[19]。根據(jù)α-乳白蛋白和β-乳球蛋白結(jié)構(gòu),本實驗選用了上述Agilent C8色譜柱。本文采用C8柱分離,目標物出峰時間短,峰形尖銳而且對稱,分離度較好,可以滿足β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的分析要求。

        采用反相高效液相色譜方法分析蛋白的流動相系統(tǒng)基本為三氟乙酸的水溶液和乙腈溶液,采用梯度洗脫,但隨著樣品的不同及色譜柱的不同,梯度洗脫條件也隨之改變。在蛋白質(zhì)的反相液相色譜分離中,初始洗脫條件下流動相中有機溶劑的濃度較低,蛋白質(zhì)與固定相間的疏水作用較強,蛋白質(zhì)幾乎完全被固定相吸附。而一旦流動相中的有機溶劑達到特定的濃度,使蛋白質(zhì)與固定相的作用小于與流動相的作用時,蛋白質(zhì)就會完全從固定相上洗脫下來,幾乎不再與固定相發(fā)生作用。本試驗嘗試了以不同比例的三氟乙酸的水溶液和乙腈溶液作流動相。當以高比例的水進行梯度洗脫時,蛋白質(zhì)的出峰時間延遲;而以高比例的乙腈進行梯度洗脫時,多肽及蛋白質(zhì)的出峰時間縮短,但α-乳白蛋白和β-乳球蛋白不能分開。在兼顧保留時間和分離度的前提下,最終選擇用于測定α-乳白蛋白的流動相及梯度洗脫條件如“1.2.1”節(jié)所述。標準品和樣品的分離結(jié)果分別見圖1、圖2 和圖3。

        圖1 α-乳白蛋白和β-乳球蛋白標樣的色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of standard protein reference

        圖2 WPI 的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of WPI

        圖3 市售α-乳白蛋白的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of commercial available α-la

        由圖2、圖3 可以看出,WPI 中β-乳球蛋白占主要部分,而α-乳白蛋白含量相對較少,市售α-乳白蛋白樣品中,α-乳白蛋白的含量相對較高,國內(nèi)對這種市售α-乳白蛋白研究較少,如進一步對其研究將具有十分重要的意義。

        2.2 線性相關(guān)性及檢出限

        按1.2.1 所述色譜條件進行測定,以峰面積為縱坐標,濃度為橫坐標做標準曲線,以信噪比S/N=3 測定α-乳白蛋白和β-乳球蛋白最小檢出限,結(jié)果見表2。

        表2 兩種乳清蛋白的線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢測限Table 2 Linear equations,correlation coefficients and detection limit of α-la and β-lg

        由表2 還可看出,兩組分在測定的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

        2.3 方法的穩(wěn)定性及重現(xiàn)性

        將配制好的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白標準溶液在室溫下保存24 h 后,按1.2.1 所述色譜條件,每樣平行測定5 次,測定α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量的相對標準偏差(RSD)分別為1.7%和2.3%。表明24 h內(nèi)對上述兩種標準品的檢測符合要求。

        精密稱取待測樣品1 各3 份,溶解定容后用針式濾器過濾處理,分別進樣10 μL,按照外標法測定其中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的含量,并計算其RSD分別為2.1%和3.1%表明該法重現(xiàn)性良好。

        2.4 加樣回收率實驗

        取樣品2 和樣品3 各3 份,分別加入一定量的標準品混合溶液,用0.22 μm 的針式濾器過濾后進樣測定,結(jié)果見表3。

        表3 回收率測定結(jié)果(n=3)Table 3 Determination results of recovery(n=3)

        由表3 可以看出,兩種樣品回收率均大于92.0%,測定標準偏差均小于5%,符合實驗要求。

        2.5 樣品的測定結(jié)果

        取一定量的樣品按1.2.3 樣品處理方法及1.2.1 色譜條件進行測定,樣品色譜圖見圖2 和圖3。由圖2、圖3 可知,樣品中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的出峰時間與其標準品的出峰時間一致,色譜分離效果很好。由于α-乳白蛋白有N 型構(gòu)象(天然構(gòu)象)和A 型構(gòu)象(酸構(gòu)象),所以α-乳白蛋白的樣品具有兩個峰。說明該方法能有效的檢測出的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白。通過外標法測得樣品中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的含量及在樣品蛋白質(zhì)中所占的比例,結(jié)果見表4。

        表4 樣品測定結(jié)果Table 4 Determination results of sample

        根據(jù)表4 可以看出,該方法可以用于檢測奶粉樣品中兩種蛋白的含量,能夠快速檢測嬰幼兒配方食品中α-乳白蛋白及β-乳球蛋白含量。

        3 結(jié)論

        利用C8色譜柱,采用HPLC 法測定牛乳中主要過敏蛋白α-乳白蛋白及β-乳球蛋白的含量,其測定條件為:Agilent-C8(4.6 mm×150 mm,5 μm)色譜柱,流動相A 為含0.5%三氟乙酸的乙腈,流動相B 為含0.1%三氟乙酸的超純水,采用梯度洗脫方法,柱溫25 ℃,流速1 mL/min,進樣量10 μL,檢測波長280 nm,外標法定量。在該條件下樣品中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白分離度較好,出峰時間適中。

        用本法測定牛乳中的主要過敏蛋白α-乳白蛋白和β-乳球蛋白,簡便易行、準確靈敏,可為乳制品的質(zhì)量評價及生產(chǎn)工藝控制提供依據(jù)。

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