韓濤，陳野，紀(jì)緒前，鄭曉晨，宋佳，劉環(huán)

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

γ-氨基丁酸（amino butyric acid，GABA）是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，廣泛存在于動(dòng)植物體中，由L-谷氨酸經(jīng)谷氨酸脫羧酶催化轉(zhuǎn)化而來(lái)，是一種重要的的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[1]。GABA 具有降低血脂、防止肥胖及活化肝、活化腎功能以及改善脂質(zhì)代謝等功能[2-3]。此外，GABA 還有促進(jìn)乙醇代謝、促進(jìn)生長(zhǎng)激素分泌的功效[4]，并且對(duì)老年癡呆癥（Alzheimer's disease）也具有良好的防治效果[5]。

近年來(lái)，糙米及發(fā)芽糙米中的GABA 成為了許多研究的焦點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，糙米經(jīng)過(guò)發(fā)芽處理，GABA含量大幅提高[6]；糙米的發(fā)芽過(guò)程可以提高谷氨酸脫羧酶活性，抑制丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶和GABA 氨酶活性，從而降低GABA 分解，使GABA 得到積累[7]。隨著日本發(fā)芽糙米產(chǎn)品的出現(xiàn)，臺(tái)灣地區(qū)也開(kāi)發(fā)出了發(fā)芽保健米，國(guó)內(nèi)學(xué)者就發(fā)芽糙米的功能性和生產(chǎn)技術(shù)也進(jìn)行了研究[8-12]。到目前為止，國(guó)內(nèi)尚無(wú)完整的富集發(fā)芽糙米中GABA 的生產(chǎn)技術(shù)的報(bào)道。本研究通過(guò)控制糙米發(fā)芽的相關(guān)技術(shù)參數(shù)，得到富含γ-氨基丁酸的發(fā)芽糙米，提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生理功能特性，為糙米和發(fā)芽糙米的深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

寧河1 號(hào)（粳稻）：天津市津源海米業(yè)有限公司；γ-氨基丁酸（GABA）標(biāo)品（純度＞99%）：SIGMA 公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）：天津市康科德科技有限公司；鄰苯二甲醛（OPA 化學(xué)純）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；β-巰基乙醇（純度＞99%）：AMERCO 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HPX-250B 型恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海悅豐儀器有限公司；TDL-5-A 型低速臺(tái)式大容量離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；Agilent-1200 型高效液相色譜儀（附紫外檢測(cè)器）、TC-C18 反相色譜柱（4.6 mm×250 mm 5 μm）：AGILENT 公司；0.45 μm 微孔濾膜（有機(jī)系）。

1.3 方法

1.3.1 糙米發(fā)芽工藝

挑選顆粒飽滿、成熟度高的糙米，蒸餾水清洗3遍，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的次氯酸鈉溶液進(jìn)行浸泡消毒10 min，再用蒸餾水清洗3 遍。然后在不同條件下浸泡、發(fā)芽，最后在80 ℃熱水中浸泡10 min 進(jìn)行滅酶處理，之后55 ℃烘箱干燥，使水分含量降至10%以下。

1.3.2 GABA 的測(cè)定

1.3.2.1 HPLC 色譜檢測(cè)條件

Agilent TC-C18 反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫40 ℃；流動(dòng)相：1.6 g CH3COONa·3H2O（pH7.2），600 mL；甲醇200 mL；乙腈200 mL；衍生試劑[13]：稱取400 mg OPA，以50 mL 甲醇溶解后加入β-巰基乙醇400 μL。（4 ℃保存）檢測(cè)波長(zhǎng)338 nm；進(jìn)樣量20 μL；流速1 mL/min。

1.3.2.2 樣品GABA 的檢測(cè)

分別將糙米和發(fā)芽糙米樣品粉碎，過(guò)40 目標(biāo)準(zhǔn)篩，于雙層密封袋中4 ℃保存。精確稱取1.0 g 米粉樣品，準(zhǔn)確加入5 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的三氯乙酸（TCA）溶液，振蕩5 min，40 ℃水浴2 h，水浴后5 000 r/min 離心20 min，取上清液進(jìn)行OPA 柱前衍生5 min，之后立即過(guò)膜，上機(jī)檢測(cè)。

1.3.2.3 GABA 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取125 mg GABA 標(biāo)品，用超純水溶解并定容至100 mL，得濃度為1 250 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液。再用上述標(biāo)準(zhǔn)溶液配成3.125、6.25、12.5、22.5、32.5、42.5 mg/L 系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以O(shè)PA 柱前衍生后進(jìn)樣檢測(cè)，以峰面積為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)液濃度為縱坐標(biāo)制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 方法與設(shè)計(jì)

1.4.1 單因素試驗(yàn)

以浸泡溫度、浸泡時(shí)間、發(fā)芽溫度和發(fā)芽時(shí)間為試驗(yàn)考察因素，以GABA 含量為試驗(yàn)考察指標(biāo)，做以下單因素試驗(yàn)：

浸泡溫度：取7 份糙米，每份15 g，分別用50 mL蒸餾水在20、24、28、32、36、40、44 ℃條件下浸泡8 h，取出滅酶，干燥，測(cè)定每份樣品的GABA 含量。

浸泡時(shí)間：在32 ℃條件下，將150 g 糙米用500 mL蒸餾水浸泡，分別在0、4、8、12、16、20、24、28、32、36 h取出，經(jīng)滅酶，干燥后，測(cè)定樣品GABA 含量。

發(fā)芽溫度：用300 mL 蒸餾水將90 g 糙米在32 ℃條件下浸泡8 h，之后分為6 份，分別放入溫度為20、24、28、32、36、40 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h 后，取出滅酶，干燥制樣，得發(fā)芽糙米，測(cè)定其GABA 含量。

發(fā)芽時(shí)間：用600 mL 蒸餾水將180 g 糙米在32 ℃條件下浸泡8 h，之后分為12 份，放入溫度為32 ℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)芽，分別在8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 h 后取出，滅酶，干燥，得到12 份不同的發(fā)芽糙米，分別測(cè)定其GABA 含量。

1.4.2 優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用四因素三水平的Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法[14]，以浸泡溫度、浸泡時(shí)間、發(fā)芽溫度以及發(fā)芽時(shí)間為研究因素，以發(fā)芽糙米GABA 含量為指標(biāo)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用Design-Expert 軟件（Version 8.0.6）對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸和方差分析，模型和因素的顯著性以F 值進(jìn)行考察（P＜0.05），所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次，以干基表示結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 GABA 的高效液相色譜檢測(cè)圖

利用柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定GABA 標(biāo)準(zhǔn)品和發(fā)芽糙米樣品的譜圖如圖1。

由圖1 可知，GABA 與其他氨基酸衍生物分離比較完全，其他雜質(zhì)對(duì)測(cè)定基本沒(méi)有干擾。

2.2 GABA 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以峰面積（×105）為橫坐標(biāo)，GABA 標(biāo)品濃度（mg/L）為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2?；貧w方程為Y=0.113 5X-0.459 2，R2=0.999 6。

圖1 GABA 的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of standard GABA

圖2 GABA 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of GABA

Y 與X 顯著相關(guān)，表明GABA 在該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 浸泡溫度對(duì)GABA 含量的影響

為了考察浸泡溫度對(duì)GABA 含量的影響，以發(fā)芽糙米中的GABA 為指標(biāo)，選取不同浸泡溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3。

圖3 浸泡溫度對(duì)GABA 含量的影響Fig.3 Effect of soaking temperature on GABA content in germinated brown rice

由圖3 可知，20 ℃～32 ℃的區(qū)間內(nèi)，GABA 含量隨溫度的升高而升高，于32 ℃時(shí)達(dá)到最大值127.64 mg/100 g；32 ℃～44 ℃范圍內(nèi)，GABA 含量隨著溫度的升高而降低。因此，最佳浸泡溫度確定為32 ℃～36 ℃之間。另外，由于測(cè)得的未發(fā)芽糙米中GABA 的含量為85.78 mg/100g，因此可以看出，發(fā)芽處理可以明顯提高糙米GABA 含量。

2.2.2 浸泡時(shí)間對(duì)GABA 含量的影響

為了考察浸泡時(shí)間對(duì)GABA 含量的影響，以發(fā)芽糙米中的GABA 為指標(biāo)，選取不同浸泡時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4。

圖4 浸泡時(shí)間對(duì)GABA 含量的影響Fig.4 Effect of soaking time on GABA content in germinated brown rice

由圖4 可知，20 h 之前，發(fā)芽糙米中GABA 含量隨浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加；浸泡時(shí)間20 h 時(shí)有最大值100.97 mg/100 g。20 h 后，發(fā)芽糙米GABA 含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減少。因此，確定浸泡時(shí)間20 h 左右為較佳浸泡時(shí)間。

2.2.3 發(fā)芽溫度對(duì)GABA 含量的影響

為了考察發(fā)芽溫度對(duì)GABA 含量的影響，以發(fā)芽糙米中的GABA 為指標(biāo)，選取不同發(fā)芽溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5。

圖5 發(fā)芽溫度對(duì)GABA 含量的影響Fig.5 Effect of germination temperature on GABA content in germinated brown rice

由圖5 可知，在32 ℃之前，GABA 含量隨著溫度的升高而逐漸增加，但溫度超過(guò)32 ℃后，曲線呈平緩趨勢(shì)。40 ℃以后迅速下降，因此，最佳發(fā)芽溫度確定為32 ℃左右。

2.2.4 發(fā)芽時(shí)間對(duì)GABA 含量的影響

為了考察發(fā)芽時(shí)間對(duì)GABA 含量的影響，以發(fā)芽糙米中的GABA 為指標(biāo)，選取不同發(fā)芽時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6。

圖6 發(fā)芽時(shí)間對(duì)GABA 含量的影響Fig.6 Effect of germination time on GABA content in germinated brown rice

由圖6 可知，GABA 含量在8 h～13 h 內(nèi)隨時(shí)間逐漸增加，在13 h～18 h 緩慢增長(zhǎng)，在18 h～23 h 時(shí)增長(zhǎng)迅速，23 h 時(shí) 達(dá) 到134.97 mg/100 g；28 h 達(dá) 到 峰 值135.79 mg/100 g，之后在28 h～43 h 內(nèi)先降低后升高，并在38 h 時(shí)GABA 含量達(dá)到又一峰值，但未超過(guò)28 h 的峰值，因此，由GABA含量確定最佳發(fā)芽時(shí)間為23h～28 h。

2.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)定浸泡溫度范圍24 ℃～40 ℃，浸泡時(shí)間范圍12 h～28 h，發(fā)芽溫度范圍28 ℃～40 ℃，發(fā)芽時(shí)間范圍18 h～33 h，采用Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化發(fā)芽條件[9]。試驗(yàn)因素水平和編碼見(jiàn)表1 所示，試驗(yàn)安排及結(jié)果如表2，回歸模型的方差分析見(jiàn)表3。

表1 Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平和編碼Table 1 Variables and levels in response surface design

2.3.1 二次多項(xiàng)式回歸模型

經(jīng)分析得到的發(fā)芽條件與GABA 含量之間的二次多項(xiàng)式模型為：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Process variables and levels in response surface central composite design and experimental results

由表3 可以看出，因素X1、X3、X2X4對(duì)發(fā)芽糙米GABA 含量影響極顯著（P＜0.01），X2、X4、X2X3對(duì)萌芽豇豆中GABA 的含量影響顯著（P＜0.05），X1X2、X1X3、X1X4、X3X4對(duì)萌芽豇豆中GABA 的含量影響不顯著（P＞0.05）。

2.3.2 兩因素間交互作用

響應(yīng)面圖及等高線圖見(jiàn)圖7～圖12，各因素及其交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響結(jié)果可通過(guò)該組圖直觀反映出來(lái)。等高線的形狀反映了交互作用的強(qiáng)弱，橢圓表示兩兩交互作用顯著，圓形則表示交互作用不顯著[15]。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for regression model

2.3.2.1 浸泡溫度和浸泡時(shí)間的交互作用

由圖7 可以看出，浸泡溫度和浸泡時(shí)間的交互作用不顯著，隨浸泡溫度和浸泡時(shí)間的增加，GABA 含量有緩慢增加后又降低，浸泡溫度過(guò)高，浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)都對(duì)發(fā)芽糙米GABA 富集不利。所以浸泡溫度在33 ℃左右，浸泡時(shí)間在20 h 左右，發(fā)芽糙米中GABA 的含量最高。

2.3.2.2 浸泡溫度和發(fā)芽溫度的交互作用

由圖8 可以看出，浸泡溫度和發(fā)芽溫度的交互作用不顯著，隨浸泡溫度和發(fā)芽溫度增加，GABA 含量緩慢增加，但是浸泡溫度和發(fā)芽溫度過(guò)高，GABA 含量下降。所以浸泡溫度在33 ℃左右，發(fā)芽溫度34 ℃左右，GABA 含量最高。

2.3.2.3 浸泡溫度和發(fā)芽時(shí)間的交互作用

由圖9 可知，浸泡溫度和發(fā)芽時(shí)間的交互作用不顯著，隨著浸泡溫度和發(fā)芽時(shí)間的增加，GABA 含量緩慢增加后又緩慢降低。浸泡溫度在33 ℃左右，發(fā)芽時(shí)間在27 h 左右，GABA 含量達(dá)到最高。

圖7 浸泡溫度（X1）與浸泡時(shí)間（X2）響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plot showing the interactive effects of soaking temperature and time on GABA content in germinated brown rice

2.3.2.4 浸泡時(shí)間和發(fā)芽溫度的交互作用

從圖10 可知，浸泡時(shí)間和發(fā)芽溫度的交互作用顯著。隨著浸泡時(shí)間和發(fā)芽溫度的增加，GABA 含量增加，但超過(guò)一定范圍后GABA 含量下降，變化較為明顯。浸泡時(shí)間在20 h 左右，發(fā)芽溫度在34 ℃左右，GABA 含量最高。

2.3.2.5 浸泡時(shí)間和發(fā)芽時(shí)間的交互作用

由圖11 可知，浸泡時(shí)間和發(fā)芽時(shí)間的交互作用達(dá)極顯著水平，面形變化明顯，隨著浸泡時(shí)間和發(fā)芽時(shí)間的增加，GABA 含量增加。但浸泡時(shí)間和發(fā)芽時(shí)間過(guò)長(zhǎng)都不利于GABA 積累。浸泡時(shí)間在20 h 左右，發(fā)芽時(shí)間在27 h 左右，有最高GAB A 含量。

2.3.2.6 發(fā)芽溫度和發(fā)芽時(shí)間的交互作用

由圖12 可知，發(fā)芽溫度和發(fā)芽時(shí)間的交互作用不顯著，隨著發(fā)芽溫度和發(fā)芽時(shí)間的增加，GABA 含量緩慢增加后又緩慢降低。發(fā)芽溫度在34 ℃左右，發(fā)芽時(shí)間在27 h 左右，GABA 的含量最高。

圖8 浸泡溫度（X1）與發(fā)芽溫度（X3）響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.8 Response surface and contour plot showing the interactive effects of soaking temperature and germination temperature on GABA content in germinated brown rice

圖9 浸泡溫度（X1）與發(fā)芽時(shí)間（X4）響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.9 Response surface and contour plot showing the interactive effects of soaking temperature and germination time on GABA content in germinated brown rice

圖11 浸泡時(shí)間（X2）與發(fā)芽時(shí)間（X4）響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.11 Response surface and contour plot showing the interactive effects of soaking time and germination temperature on GABA content in germinated brown rice

圖12 發(fā)芽溫度（X3）與發(fā)芽時(shí)間（X4）響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.12 Response surface and contour plot showing the interactive effects of germination time and temperature on GABA content in germinated brown rice

2.3.3 模型的優(yōu)化與驗(yàn)證

通過(guò)優(yōu)化分析得到最佳的發(fā)芽條件為浸泡溫度34.23 ℃、浸泡時(shí)間21.73 h、發(fā)芽溫度33.44 ℃、發(fā)芽時(shí)間26.53 h，發(fā)芽糙米中GABA 含量預(yù)測(cè)值為188.76 mg/100 g，依據(jù)實(shí)際情況，選擇浸泡溫度34 ℃、浸泡時(shí)間21 h、發(fā)芽溫度33 ℃和發(fā)芽時(shí)間26 h 進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到GABA 的含量為189.58 mg/100 g，與預(yù)測(cè)值接近。

3 結(jié)論

通過(guò)響應(yīng)面法建立了浸泡溫度、浸泡時(shí)間、發(fā)芽溫度以及發(fā)芽時(shí)間四因素的回歸模型：

依據(jù)回歸方程與實(shí)際情況得最優(yōu)的工藝參數(shù)為浸泡溫度34 ℃、浸泡時(shí)間21 h、發(fā)芽溫度33 ℃、發(fā)芽時(shí)間26 h，GABA 的含量達(dá)189.58 mg/100 g，與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明了建立的回歸模型能夠很好的預(yù)測(cè)糙米發(fā)芽條件與GABA 含量之間的關(guān)系。同時(shí)說(shuō)明了響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)芽糙米富集GABA 參數(shù)的可行性。

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