宋曉凱 ，許瑞波，曹志凌，郭 雷，李 靖，李志華

寶華玉蘭(Magnolia zenii Cheng.)為木蘭科(Magnoliaceae)木蘭屬的落葉小喬木，為中國特有植物，花、果均可入藥。在2004 年《中國植物紅色名錄》中被列為國家級極危種。有關(guān)寶華玉蘭的研究相對較少，僅見對其外部形態(tài)、花粉特征、自然分布狀況及群落學(xué)調(diào)查的簡要記錄［1-3］。近期，本實驗室對寶華玉蘭樹皮揮發(fā)性成分進行了GCMS 分析研究，共鑒定出50 種成分［4］。為系統(tǒng)研究寶華玉蘭的抗炎抗腫瘤作用，本實驗室對寶華玉蘭種子總提取物進行了NF-κB、IκBα 表達的抑制作用機制的研究。

1 材料和方法

1.1 試劑 抗磷酸化IκBα 抗體、NF-κB 抗體及人肝癌細胞HepG2，所有實驗用試劑等均由南京凱基生物科技有限公司提供(均為分析純)。陽性對照:Taxol(紫杉醇，批號:20090403，太極集團四川太極制藥有限公司生產(chǎn)，含量:10 μg/mL)。寶華玉蘭全株植物于2010 年6 月采自江蘇省句容市茅山鎮(zhèn)永興苗木場(系人工種植)，經(jīng)淮海工學(xué)院宋曉凱教授鑒定為木蘭科木蘭屬植物寶華玉蘭。

1.2 寶華玉蘭種子總提取物(Extract from seeds of Magnolia zenii.，ESMZ)的制備 將干燥寶華玉蘭種子置不銹鋼容器，加相當(dāng)于藥材8 倍量體積工業(yè)酒精浸泡4 個月，提取3 次，合并提取液，過濾，回收酒精成流浸膏狀，60 ℃下水浴上蒸發(fā)至無乙醇味，冷卻后得褐色半固體提取物，待用。以少量DMSO 溶解ESMZ，并仍以DMSO 為溶劑，制成6.25、12.5、25 μg/mL 的溶液(依次為低、中、高濃度組)，于-20 ℃保存。

1.3 細胞培養(yǎng) 人肝癌細胞HepG2 生長在含有10%牛血清、100 U/mL 青霉素、100 U/mL 鏈霉素的RPMI 1640 中。于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.4 Western blotting 法檢測NF-κB 及IκBα 溶解20 μg 蛋白，使用10%變性SDS(十二烷基磺酸鈉)電泳分離。轉(zhuǎn)蛋白到尼龍膜上。使用特異的抗體和過氧化物酶連接的IgG 抗體，通過免疫染色發(fā)現(xiàn)磷酸化IκBα。用增強化學(xué)發(fā)光法(ECL)觀察NF-κB 及IκBα 蛋白帶。

2 結(jié)果

2.1 ESMZ 能明顯抑制NF-κB 蛋白的表達 在HepG2 細胞，ESMZ 可抑制IκBα 的磷酸化和降解，進而抑制NF-κB 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。由圖1(b)可見，高、中濃度的ESMZ 對NF-κB 蛋白表達的抑制作用均比低濃度ESMZ 的抑制作用強，表明高、中濃度的ESMZ 對NF-κB 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性抑制作用均強于低濃度ESMZ 的抑制作用。

2.2 ESMZ 抑制IκBα 的磷酸化和降解 NF-κB移位到核內(nèi)首先要通過IκBα 的磷酸化和蛋白降解。為確定ESMZ 是否引起IκBα 降解，使用Western blotting 法，用不同濃度ESMZ 處理細胞后，測量IκBα 的水平。如圖1(c)可見，不同濃度的ESMZ 處理HepG2細胞后，以濃度依賴方式導(dǎo)致IκBα 蛋白表達明顯降低。用ESMZ 處理HepG2 細胞后，明顯引起IκBα 磷酸化。

圖1 經(jīng)ESMZ 處理后的NF-κB 及IκBα 的蛋白表達變化情況

3 討論

NF-κB 激活在炎癥反應(yīng)和控制細胞增殖的發(fā)病機制中起著重要的作用。故環(huán)氧化酶-2(COX-2)特異抑制劑的抗炎和抗腫瘤作用可能部分通過抑制NF-κB 而發(fā)揮作用。大部分NF-κB 活化抑制劑通過抑制IκBα 激酶活性，隨之抑制IκBα 的磷酸化和降解［5-7］。

本實驗結(jié)果首次證明，ESMZ 可以下調(diào)NF-κB介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性，對IκBα 的磷酸化和降解均有作用，IκBα 蛋白的表達水平隨ESMZ 濃度的增加而逐漸下降。ESMZ 通過阻止IκBα 的磷酸化和降解而阻斷NF-κB 信號通路，抑制NF-κB 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。提示ESMZ 可能是部分通過對IκBα/NF-κB通路的阻斷，抑制NF-κB 活化而發(fā)揮抗炎和抗腫瘤作用。

致謝:南京凱基生物科技有限公司協(xié)助完成一部分實驗工作，在此致謝。

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