尹明曉，張金杰，翁遠(yuǎn)超，趙慶春*

枳實(shí)始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為蕓香科植物酸橙(Citrus aurantium L.)及其栽培變種或甜橙(Citrus sinensis Osbeck)的干燥幼果，具有破氣消積、化痰散痞的功效［1］。本品的主要成分為二氫黃酮苷類。為了有效提取其有效成分，本實(shí)驗(yàn)采用乙醇提取方法，用L9(34)正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)，優(yōu)化枳實(shí)中3 種二氫黃酮苷的最佳提取工藝。

1 材料與儀器

1.1 材料 枳實(shí)購(gòu)于沈陽(yáng)四方大藥房，經(jīng)沈陽(yáng)藥科大學(xué)教授孫啟時(shí)教授鑒定為蕓香科植物甜橙的干燥幼果。乙腈為色譜純;醋酸、磷酸均為分析純(國(guó)藥集團(tuán));水為5 次蒸餾水(試驗(yàn)自制)。柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷均從枳實(shí)中分離得到，均通過(guò)核磁鑒定，純度＞98%，符合分析定量要求。

1.2 儀器 Waters 600 controller、Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector(美國(guó)waters 公司);十萬(wàn)分之一分析天平(日本SHIMADZU AUW120D);數(shù)顯恒溫水浴鍋(丹瑞HH-D4);粉碎機(jī)(屹立)。

2 方法與結(jié)果

2.1 柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷的含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取柚皮苷對(duì)照品4.8 mg、新橙皮苷對(duì)照品4.5 mg、橙皮苷對(duì)照品6.0 mg，置50 mL 量瓶，加50%乙醇溶解，定容至刻度，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取濾液備用。

2.1.2色譜條件色譜柱:Welchrom C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈-0.5%磷酸溶液(18 ∶72)［2］;檢測(cè)波長(zhǎng):283 nm;柱溫:30 ℃;流速:1.0 mL/min。

2.1.3 供試品溶液的制備 取枳實(shí)粉末10 g，精密稱定，置100 mL 圓底燒瓶中，加入10 倍量50%乙醇，回流提取1 次，每次1.5 h，合并濾液，水浴蒸干，分別用50%乙醇溶解，置10 mL 量瓶，定容至刻度，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.1.4 線性范圍的考察 精密吸取對(duì)照品溶液10、20、30、40、50、60、70 μL，分別定容至50 mL 量瓶，搖勻。吸取上述溶液10 μL 進(jìn)樣，每份進(jìn)樣3次，記錄色譜峰面積。以對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，3個(gè)峰的理論塔板數(shù)均＞5 000，分離度均＞1.5，符合試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。見(jiàn)表1、圖1。

2.1.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精確吸取3 種黃酮苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液各10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖，計(jì)算峰面積RSD 分別為2.1%、1.7%、0.8%，表明精密度符合要求。

2.1.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取枳實(shí)樣品，按“2.1.3”項(xiàng)方法處理，分別0、2、4、6、8、12、24 h測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算峰面積RSD 分別為2.0%、1.8%、1.6%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表1 枳實(shí)中柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷的線性回歸方程

圖1 樣品液相色譜圖

2.1.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取枳實(shí)粉末6 份，按“2.1.3”項(xiàng)方法處理，在上述色譜條件下測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算峰面積RSD 分別為2.7%、2.5%、2.3%，結(jié)果表明，本方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 稱取枳實(shí)粉末10 份，每份1.0 g，精密稱定。其中1 份不加對(duì)照品，作為隨行對(duì)照;其余9 份中，3 份為1 組，分別加入高、中、低3 個(gè)濃度的柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷對(duì)照品，進(jìn)樣10 μL。記錄色譜圖，加樣回收率分別為100.9%、102.2%、102.3%。RSD 分別為1.13%、1.10%、0.78%，符合試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 正交試驗(yàn)篩選枳實(shí)中3 種二氫黃酮苷的提取工藝［3］

2.2.1 提取工藝中單因素的考察 ①乙醇濃度考察:取4 份枳實(shí)粉末各10 g，精密稱定，置100 mL 圓底燒瓶中，分別加入30%、40%、50%、60%乙醇提取。結(jié)果表明，50%乙醇提取效果最好。②乙醇用量考察:取4 份枳實(shí)粉末各10 g，精密稱定，置100 mL 圓底燒瓶中，分別加入8、10、12、14 倍量的50%乙醇。提取相同時(shí)間，結(jié)果表明，10 倍量體積的乙醇提取效果較好。③提取時(shí)間考察:取4 份枳實(shí)粉末各10 g，精密稱定，置100 mL 圓底燒瓶中，分別加入10 倍量的50%乙醇。分別提取1、1.5、2、2.5 h，結(jié)果表明，1.5 h 的乙醇提取效果較好。④提取次數(shù)考察:取4 份枳實(shí)粉末各10 g，精密稱定，置100 mL 圓底燒瓶中，分別加入10 倍量的50%乙醇。分別提取1、2、3 次，每次提取1.5 h。結(jié)果表明，提取2 次較好。

2.2.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 稱取枳實(shí)藥材10 g，以乙醇濃度、乙醇用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)為影響因素，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果設(shè)定3 個(gè)水平，以1 g 藥材中所含有的柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷的含量為指標(biāo)，按照L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)［4］，見(jiàn)表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素

2.2.3 結(jié)果 正交試驗(yàn)結(jié)果、方差分析見(jiàn)表3、表4。由表3、表4 可見(jiàn)，根據(jù)綜合評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，A ＞(B =C)＞D。因此，最佳提取工藝為A2B1C2D1。即8 倍量的50%乙醇提取1 次，每次提取1.5 h。

表3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表格

表4 方差分析結(jié)果

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 按照上述優(yōu)選工藝，提取3 批藥材，計(jì)算柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷含量(見(jiàn)表5)。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本試驗(yàn)對(duì)枳實(shí)中3 種主要有效成分—柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)的方法，確定了乙醇濃度、提取時(shí)間、提取次數(shù)以及乙醇用量4 個(gè)影響因素，確定了最佳提取工藝為8 倍量的50%乙醇提取1 次，每次提取時(shí)間為1.5 h。結(jié)果表明，該方法提取枳實(shí)中的3 種二氫黃酮苷類化合物，工藝簡(jiǎn)單、提取率高、操作容易，為枳實(shí)的工業(yè)生產(chǎn)提供了合理的依據(jù)。

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:816-817.

［2］ 姜華，李軍，石任兵，等.HPLC 法測(cè)定枳實(shí)黃酮有效部位中3種二氫黃酮的含量［J］.中國(guó)藥房，2008，27(2):2127-2128.

［3］ 謝貞建，焦士蓉，唐鵬程，等.枳實(shí)總黃酮提取工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2009，30(7):41-44.

［4］ 胡靜，尚?；?，王陽(yáng)，等.正交試驗(yàn)優(yōu)選枳實(shí)中辛弗林提取工藝［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(13):22-23.