李厚忠張羽飛齊 敏李孟全

咳爾康口服液對哮喘大鼠TNF-α和SOD mRNA表達(dá)的影響※

李厚忠1張羽飛1齊 敏2李孟全1

目的觀察咳爾康口服液對哮喘模型大鼠TNF-α和SOD活力及其 mRNA表達(dá)的影響，闡明咳爾康口服液治療哮喘的可能機(jī)制。方法SD大鼠隨機(jī)分為四組：正常對照組、模型組、陽性對照組和咳爾康口服液實(shí)驗(yàn)組。采用卵蛋白和氫氧化鋁制備哮喘模型大鼠，觀察咳爾康口服液對大鼠TNF-α和SOD mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果與正常對照比較，模型組大鼠TNF-α mRNA表達(dá)明顯升高；與模型組相比，咳爾康口服液可以降低TNF-α mRNA表達(dá)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與正常對照比較，模型組大鼠SOD mRNA表達(dá)明顯降低；與模型組相比，咳爾康口服液可以升高SOD mRNA表達(dá)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論TNF-α和SOD可能參與哮喘的發(fā)生，而咳爾康口服液治可以抑制TNF-α mRNA表達(dá)水平，同時也可以升高SOD mRNA表達(dá)水平，改善哮喘的癥狀。

咳爾康口服液；哮喘；TNF-α；超氧化物歧化酶

咳爾康口服液是在經(jīng)典名方“六君子湯”基礎(chǔ)之上，經(jīng)過反復(fù)多年實(shí)踐潛心研究衍化而成。主要成分包括茯苓、陳皮、甘草、紫苑、白術(shù)等，具有理氣健脾燥濕，化痰止咳之功效。本課題組前期研究結(jié)果表明該制劑作用機(jī)制可能與降低NO和MDA濃度有關(guān)[1]，長期毒性實(shí)驗(yàn)也未見明顯毒性反應(yīng)[2]。

細(xì)胞因子TNF-α是一種多效應(yīng)的生物活性分子，也是哮喘發(fā)病過程中的一個重要的啟動因子，它作為氣道強(qiáng)而有力的刺激劑，可以誘導(dǎo)一系列細(xì)胞因子的產(chǎn)生。SOD是機(jī)體重要的抗氧化酶類，作為氧化——抗氧化研究的經(jīng)典指標(biāo)，得到廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)以TNF-α和SOD為研究對象，研究在哮喘模型大鼠血清中TNF-α濃度和SOD活力的變化以及其基因表達(dá)情況，評價TNF-α和SOD在哮喘發(fā)病過程中的作用，為進(jìn)一步研究咳爾康口服液治療哮喘的機(jī)制提供參考資料，也為該制劑在臨床應(yīng)用中提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試藥咳爾康口服液制備：處方藥材用清水速洗，水煎兩次，合并煎液，除塵，濃縮至規(guī)定量，分裝滅菌既得，黑龍江仁和堂藥業(yè)有限公司代加工。

1.1.1 動物健康清潔級 SD系大鼠40只，雌雄各半，體重190～210g，購于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動物合格證號為：P00102008，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（黑）2008-033。

1.1.2 儀器和試劑恒溫水浴箱（天津泰斯鵬儀器有限公司）；微量加樣器（德國eppendorf）；自動平衡離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司）；電子天平（日本島津）；超聲霧化器（江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司）；PCR儀（美國Bio-Rad公司）；NanoDrop2000（美國Thermo Fisher公司）；BioAnalyzer 2100（美國Agilent公司）。RNA 提取液（TRIzol，美國Invitrogen公司）；RT-PCR試劑盒（購自寶生物工程有限公司）；瓊脂糖（Agarose）；EB（美國sigma公司）；卵蛋白（OVA，美國Sigma 公司）；潑尼松（天津力生制藥股份有限公司）；TNF-α測試盒（美國ADL公司）；SOD測試盒（南京建成生物工程研究所）。其余試劑均為國產(chǎn)分析純（北京化工廠）。

1.2 方法

1.2.1 給藥方法健康清潔級SD大鼠腹腔內(nèi)注射10%卵蛋白+10%氫氧化鋁混合液1ml作為首次致敏，第15天將大鼠依次置于超聲霧化器中，用1%卵蛋白生理鹽水噴霧激發(fā)大鼠哮喘發(fā)作，隔日一次，一次20min，共激發(fā)28d。以大鼠出現(xiàn)口唇發(fā)紺、腹肌痙攣、呼吸加快、點(diǎn)頭呼吸或站立不穩(wěn)等表現(xiàn)表示成功激發(fā)。將成功制備的哮喘模型大鼠（40只）隨機(jī)分為四組（每組10只），分別為咳爾康口服液給藥組（Experimental group）、模型組（Model group）、陽性對照組（Positive group）、另設(shè)正常對照組（Control group，10只以生理鹽水代替卵蛋白進(jìn)行腹腔注射及霧化吸入給藥）。分組后每天灌胃給藥，正常對照組和模型組給予等量生理鹽水，陽性對照組給予潑尼松10 ml/kg體重，給藥組給予咳爾康口服液1.66ml/200g體重，每天1次，連續(xù)28d。最后1次給藥后2h頸靜脈采血2ml，于3000r/min離心機(jī)離心10min后取上清液待檢測TNF-α濃度和SOD活力。右肺組織取出后，立即置于-80℃冰箱中保存，用于TNF-α與SOD基因mRNA的檢測。

1.2.2 肺組織總RNA提取及質(zhì)量鑒定按照TRIzol試劑說明書的步驟，逐步提取出各組肺組織的總RNA。應(yīng)用NanoDrop2000測定總RNA 的吸光度A260 值和A280值，用A260 值計算其濃度，并計算A260/A280檢測其純度；使用2100生物分析儀器進(jìn)一步檢測總RNA質(zhì)量。

1.2.3 RT-PCR肺組織TNF-α和SOD mRNA表達(dá)水平檢測使用RNA 1μg 以及oligo（dT）引物，使用RT-PCR試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成單鏈的cDNA。cDNA 產(chǎn)物保存在-20℃。RT-PCR 反應(yīng)體系：體積為20μL，SYBR Green Taq Ready Mix 10 μL，dNTP正向和反向引物1μL，水7μL 和cDNA 1μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃升溫2 min；95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s；60℃退火1 min；擴(kuò)增40 個循環(huán)。每個樣本以內(nèi)參基因Rps16調(diào)整。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳后通過凝膠成像分析系統(tǒng)觀察并保存圖像。引物序列見表1。

表1 RT-PCR 引物序列

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，統(tǒng)計學(xué)處理均采用t檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 咳爾康口服液對哮喘模型大鼠血清TNF-α濃度和SOD活力的影響

表2 咳爾康口服液對哮喘模型大鼠血清TNF-α濃度和SOD活力的影響(n=10,±s)

表2 咳爾康口服液對哮喘模型大鼠血清TNF-α濃度和SOD活力的影響(n=10,±s)

注：與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與正常對照組比較※P＜0.05

組別 TNF-α(umol/L) SOD(U/mgprot)正常對照組 6.15±1.04 109.64±15.91模型組 9.94±1.72※99.88±16.62※陽性對照組 4.93±1.12**169.17±14.09**給藥組 6.57±1.50*115.44±9.43*

咳爾康口服液對TNF-α濃度的影響見表2，模型組的TNF-α濃度與正常對照組比較明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；給藥組的TNF-α濃度與模型組比較明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。模型組的SOD活力濃度與正常對照組比較明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；給藥組的SOD活力與模型組比較明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 總RNA 的質(zhì)量檢測用Trizol溶液分別提取肺組織總RNA，操作按試劑盒進(jìn)行。NanoDrop2000測定總RNA濃度（260nm），A260/280值在1.8～2.1之間，A260/230大于1.8，說明很酸純度較高（比值未列出）。使用2100生物分析測定總RNA完整性，完整性RIN均為10，表明RNA無降解，質(zhì)量可靠（圖1）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各樣本RNA 均有較好的質(zhì)量，完全可以滿足后續(xù)的RT-PCR 的實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 部分樣品RNA完整性檢測

2.3 咳爾康口服液對哮喘模型大鼠支氣管平滑肌TNF-α和SOD mRNA的表達(dá)情況圖2結(jié)果顯示，哮喘模型大鼠SOD mRNA的表達(dá)較對照組降低，TNF-α mRNA的表達(dá)較正常對照組增高。哮喘給藥處理后，大鼠SOD mRNA的表達(dá)有所升高，TNF-α mRNA的表達(dá)有所降低，與陽性對照組表達(dá)一致。

圖2 PCR結(jié)果

3 討論

支氣管哮喘是臨床上常見的慢性多發(fā)疾病，具有反復(fù)發(fā)作、遷延難愈的特點(diǎn)。在哮喘的發(fā)病過程中，有多種炎癥基因表達(dá)增加或多種炎癥基因異常表達(dá)的炎癥反應(yīng)。TNF-α是由單核巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的一種多肽細(xì)胞炎性介質(zhì)，與機(jī)體的炎癥、免疫反應(yīng)有著十分密切的關(guān)系，在哮喘的發(fā)病過程中起重要作用。正常人血清TNF-α的濃度很低，適量的TNF-α對機(jī)體的保護(hù)反應(yīng)是必需的，但當(dāng)TNF-α受到過敏原等刺激后可大量釋放，加重氣道炎癥以及引起哮喘發(fā)作[3]。哮喘發(fā)作期患者TNF-α濃度明顯高于緩解期及正常對照組，而且哮喘病情越嚴(yán)重，持續(xù)時間越長，其血清TNF-α濃度越高[4]，這與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果恰恰相符。本實(shí)驗(yàn)中，采用ELISA法測定了哮喘模型大鼠血清TNF-α濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)哮喘模型大鼠血清TNF-α濃度均較正常對照組明顯增高，由此可以認(rèn)為TNF-α參與了哮喘的發(fā)生。而后進(jìn)一步應(yīng)用RT-PCR法測定了哮喘模型大鼠肺組織TNF-α mRNA的表達(dá)。結(jié)果表明，哮喘模型大鼠TNF-α mRNA的表達(dá)較正常對照組增高，說明哮喘模型大鼠TNF-α濃度升高可能系由肺組織TNF-α mRNA表達(dá)增加，TNF-α生成增多，釋放入血所致。由此可見，TNF-α與哮喘有著密切關(guān)系，參與哮喘的病理生理過程。給藥組給予咳爾康口服液干預(yù)治療后，哮喘模型大鼠血清TNF-α濃度明顯降低，同時肺組織TNF-α mRNA表達(dá)也相應(yīng)降低，由此可以認(rèn)為，咳爾康口服液可能是通過降低哮喘模型大鼠肺組織TNF-α mRNA表達(dá)進(jìn)而降低血清中TNF-α濃度來發(fā)揮緩解哮喘的發(fā)作。

超氧化物歧化酶（SOD）是體內(nèi)重要的抗氧化酶，其活性可衡量體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)防御自由基損傷的能力[5]。研究表明哮喘發(fā)作過程中可產(chǎn)生大量氧自由基。氧自由基能顯著增強(qiáng)細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化作用，消耗大量SOD損害氣道壁上皮細(xì)胞，促進(jìn)氣道高反應(yīng)性和氣道重塑形成而引起哮喘[6]。本實(shí)驗(yàn)研究表明，哮喘模型大鼠模型組SOD活力明顯低于正常對照組（P＜0.05），而肺組織SOD mRNA的表達(dá)亦低于正常對照組，這表明SOD可能參與哮喘的發(fā)生?？葼柨悼诜嚎稍黾覵OD mRNA的表達(dá)進(jìn)而升高血清SOD活力，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力。

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Keerkang Oral Liquid on the Expression of TNFαand SOD mRNA in Asthmatic Rats

Li Houzhong Zhang Yufei Qi Min Li Mengquan

ObjectiveTo evaluate the effect of Keerkang Oral Liquid on activities of TNF-α and SOD and the expression of TNF-α and SOD mRNA in asthmatic rats.MethodsThe asthmatic models were established by injecting ovalbumin (OVA) into abdomen and atomization, then treated with Keerkang Oral Liquid.The serum was collected for detecting the levels of TNF-α and SOD .Lung tissues were ground into homogenate and the expression of TNF-α and SOD mRNA was assayed using RT-PCR.ResultsCompared to control group, the levels of TNF-α mRNA were significantly higher, but the expression of SOD mRNA decreased in asthmatic group.After Kerkang oral liquid treatment, the levels of TNF-α mRNA were significantly lower, and the expression of SOD mRNA increased in therapeutic group compared to the asthmatic group.ConclusionKeerkang Oral Liquid could decrease the expression of TNF-α mRNA and increase the expression of SOD mRNA.So it might have certain preventive and therap- SODeutic effect on Asthma.

Keerkang Oral Liquid; Asthma; TNF-α; Superoxide dismutase

R99

A

1673-5846(2013)08-0193-03

1牡丹江醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，黑龍江牡丹江 157011

2牡丹江醫(yī)院附屬二院，黑龍江牡丹江 157011

黑龍江省衛(wèi)生廳科研課題（編號：2010-233）；黑龍江省中醫(yī)藥管理局（編號：ZHY10-W73）

李厚忠（1979-），男，黑龍江省哈爾濱市呼蘭區(qū)人，碩士，主要從事藥理學(xué)和毒理學(xué)研究。

李孟全（1962-），女，博士，教授，主要從事心血管藥理學(xué)研究工作。Email：lmq6204@126.com。