馬燕斌 李瑞明 劉 怡 張俊鵬 林銀奎 梁耀榮

超聲法提取山楂果實(shí)中總黃酮的工藝研究※

馬燕斌 李瑞明 劉 怡 張俊鵬 林銀奎 梁耀榮

目的建立超聲法提取山楂果實(shí)總黃酮的最佳提取工藝。方法以總黃酮收率為指標(biāo)，正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化山楂總黃酮的提取工藝。結(jié)果最佳超聲提取工藝：乙醇濃度為70%，料液比為1：20，超聲提取時(shí)間為40min，提取率3.85%。結(jié)論該方法可用于山楂總黃酮的提取，提取方法簡(jiǎn)單易行、提取時(shí)間短、效率高。

山楂；總黃酮；正交設(shè)計(jì)法

山楂為薔薇科山楂屬植物山里紅Crataegus p.innatifida Bge.var.major N.E.Br.或山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥成熟果實(shí)，是一種重要的藥食兩用資源[1-2]。山楂是我國(guó)特有的藥果兼用樹種，中藥山楂在我國(guó)的應(yīng)用歷史悠久，李時(shí)珍的《本草綱目》記載：此品“酸甘味溫，消食積，補(bǔ)脾”。山楂具有較多的功能，即消食健胃、行氣散瘀；可用于肉食積滯、瀉痢腹痛、瘀血經(jīng)閉、心腹刺痛、高血脂癥等[3]。山楂的化學(xué)成分包括三萜類、黃酮類、原花青素、有機(jī)酸等[4]。山楂具有較好的藥理活性，如強(qiáng)心[5]、降血脂[6-7]和抗氧化[8]。蘆丁、兒茶素、原花青素等黃酮類成分為山楂中的主要活性成分。臨床研究表明，山楂的醇提物可以增加充血性心臟衰竭患者的運(yùn)動(dòng)耐量[5]，還可以誘導(dǎo)AMPK的磷酸化，降低葡萄糖和甘油三酯的生成，降低血糖、甘油三酯和膽固醇[9]。山楂的無糖水提物的主要成分為綠原酸、原花青素B2、（-）-兒茶素、蘆丁和異槲皮素，它可能通過改善脂質(zhì)代謝，減少炎癥細(xì)胞因子，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞來降低甘油三酯和膽固醇，抑制動(dòng)脈粥樣硬化[10]。本研究針對(duì)如何利用超聲法提取山楂果實(shí)中總黃酮進(jìn)行研究，為山楂中黃酮類成分的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 主要儀器SB25-12D臺(tái)式超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；UV/VIS 916紫外-可見分光光度計(jì)（島津公司）；SHZ-D循環(huán)水式真空泵（鞏義予華儀器有限公司）；電子分析天平（Sartorius公司）。

1.2 試劑與材料蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)100080-200707）；95%乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠；山楂果實(shí)（產(chǎn)地為山東棗莊）。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，采用乙醇作為溶媒可將山楂中黃酮類成分提取得到。乙醇提取山楂總黃酮的提取工藝與乙醇濃度、料液比和提取時(shí)間等因素有關(guān)，因此采用三因素三水平L9（34）進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，其因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

2.2 山楂總黃酮的提取及檢識(shí)先將山楂粉碎后過10目篩，精密稱取山楂粉末5.0g，按照正交設(shè)計(jì)結(jié)果進(jìn)行超聲提取，提取3次。提取完成后合并提取液，抽濾，并用少量相應(yīng)濃度的乙醇洗滌濾渣。將濾液轉(zhuǎn)移至量筒中，加入適量體積的乙醇，使其體積與反應(yīng)前保持一致，4℃保存，備用。

黃酮類成分的檢識(shí)：①（Molish反應(yīng)）精密吸取上述濾液各1.00mL，置于小試管中，加乙醇0.5mL，加α-萘酚數(shù)mg，斜置試管，沿管壁加入濃硫酸約0.50mL，靜置，觀察二層溶液界面的變化，有紫紅色環(huán)出現(xiàn)。②（鹽酸-鎂粉反應(yīng)）用移液管吸取上述濾液各1.00mL，置于小試管中，加鎂粉25mg，滴加濃硫酸，溶液由黃變紅。以上反應(yīng)證明溶液中可能含有蘆丁等黃酮類物質(zhì)。

2.3 對(duì)照品溶液的制備精密稱取在120℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品12.50mg，置25mL量瓶中，加適量無水乙醇溶解，加無水乙醇至刻度，搖勻，配制成每1mL中含無水蘆丁0.50mg的溶液。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取對(duì)照品溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL，分別置25mL量瓶中，各加水至6mL，加5%亞硝酸鈉溶液1mL，搖勻，放置6min，加10%硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置6min，加氫氧化鈉試液10mL，再加水至刻度，搖勻，放置15min，以相應(yīng)試劑為空白，立即按照紫外-可見分光光度法，在500nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得蘆丁的線性回歸方程為A=19.716C－0.043，r=0.9993，表明蘆丁的質(zhì)量濃度在20～120μg/mL范圍內(nèi)與吸光度值線性關(guān)系良好。

2.5 樣品的測(cè)定精密量取0.20mL“2.2項(xiàng)”下提取所得山楂總黃酮提取液置于25mL容量瓶中，各加水至6mL，以下同“2.4項(xiàng)”操作，在500nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。含總黃酮以無水蘆?。–27H30O16）計(jì)，結(jié)果如表2、3所示。

表2 山楂總黃酮含量測(cè)定結(jié)果(n=3,%)

表3 方差分析表

由表2和表3可知，三種因素對(duì)提取效果影響大小依次為：B料液比＞A乙醇濃度＞C超聲提取時(shí)間。其中料液比影響最大，其次是乙醇濃度。由表可確定最佳提取工藝條件為A2B3C3，即超聲提取最優(yōu)條件為：乙醇濃度70%，料液比1：20，提取時(shí)間40min。

2.6 最佳提取工藝的驗(yàn)證為進(jìn)一步考察上述最佳工藝的穩(wěn)定性和合理性，按該工藝條件進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)3次，分別測(cè)定山楂總黃酮的含量，結(jié)果見表4。

表4 提取工藝的驗(yàn)證結(jié)果(mg,%)

測(cè)定的結(jié)果均等于或優(yōu)于正交實(shí)驗(yàn)表中的任何一組，重現(xiàn)性好，說明該工藝穩(wěn)定可行。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理本實(shí)驗(yàn)中相關(guān)數(shù)據(jù)的處理使用EXCEL和統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0。

3 討論

黃酮類化合物在其基本碳架上含有堿性氧原子，而絕大多數(shù)都是帶有酚性羥基的衍生物，因而能與某些金屬離子產(chǎn)生絡(luò)合反應(yīng)和某些較強(qiáng)的還原劑發(fā)生顏色反應(yīng)。故可采用紫外-可見分光光度法測(cè)定提取液中總黃酮。因此選擇以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，硝酸鋁為顯色劑，測(cè)定山楂中總黃酮含量。通過提取工藝的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，最佳工藝的結(jié)果大于正交實(shí)驗(yàn)表中的任何一組，重現(xiàn)性好，說明該工藝穩(wěn)定可行。超聲波提取方法具有操作簡(jiǎn)單、作用時(shí)間短、提取效率高、提取物純度高、無需加熱、剩余物無有害殘留、可以綜合利用等優(yōu)點(diǎn)。此外，采用乙醇超聲提取方法簡(jiǎn)便易行，節(jié)約有機(jī)溶劑，所用試劑對(duì)人體較為安全。因此適于大規(guī)模生產(chǎn)，剩余物為糖果膠蛋白質(zhì)和纖維素等，可以作為食品原料加以綜合利用。

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Study on Extraction Process of Total Flavonoids from Fruits ofCrataegus pinnatifida Bge.by Uultrasonic Extraction Method

Ma Yanbin Li Ruiming Liu Yi Zhang Junpeng Lin Yinkui Liang Yaorong

ObjectiveTo establish the extraction process of total flavonoids from fruits ofCrataegus pinnatifida Bge.by ultrasonic method.MethodsOrthogonal design was used to optimize the extraction process of total flavonoids from fruits ofCrataegus pinnatifida Bge.with asset recovery ratio of total flavonoids index tried to evaluate.ResultsThe optimum extraction conditions were confirmed as follows:concentration of ethanol was 70%,extraction time was 40 min,ratio of to solid liquid was 1:20,The extraction rate of flavonoids under this condition was 3.85%.The experimental values agreed with the predicted values.ConclusionThe extraction method of total flavonoids was simple, reasonable and efficiency with short time.

Crataegus pinnatifida Bge.; Total flavonoids; Orthogonal design

R284.2

A

1673-5846(2013)08-0030-03

中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，廣東廣州 510080

廣東省重大科技專項(xiàng)項(xiàng)目（2011A080300004）；廣東省中醫(yī)藥局科研項(xiàng)目（20121145）；廣州市生物產(chǎn)業(yè)示范工程發(fā)展專項(xiàng)項(xiàng)目（2012-243）

馬燕斌（1977.6-），女，本科，主管藥師，主要研究中藥和醫(yī)院藥學(xué)。E-mail：179621079@qq.com。

李瑞明（1974.7-），男，本科，主管藥師，主要研究方向?yàn)獒t(yī)院制劑。E-mail：liruiming321@163.com。