張明森 丘力功 韋 劍 王燦頂 黃 明

利用菌體生長限制效應(yīng)的HBV DNA疫苗發(fā)酵工藝※

張明森 丘力功 韋 劍 王燦頂 黃 明

目的對HBV DNA疫苗工程菌的發(fā)酵工藝進行優(yōu)化。方法首先通過搖瓶培養(yǎng)確定基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成，提高單位菌量的質(zhì)粒表達量。其次，在40 l發(fā)酵階段，通過溶氧反饋調(diào)節(jié)的補料方式產(chǎn)生生長限制效應(yīng)，進一步獲得高拷貝表達質(zhì)粒的菌體。結(jié)果培養(yǎng)基優(yōu)化后的工程菌DH5α/pS2S發(fā)酵最終可獲得質(zhì)粒304.99mg/l，質(zhì)粒含量可達到2.40mg/g濕菌，超螺旋質(zhì)粒DNA的比例達95%以上。結(jié)論已建立了在單位體積和單位菌量內(nèi)高表達質(zhì)粒HBV DNA疫苗工程菌的發(fā)酵工藝，為HBV DNA疫苗的工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

治療性HBV DNA疫苗；工程菌；發(fā)酵；生長限制

治療性HBV DNA疫苗項目為正在進行臨床研究的國家I類新藥項目。HBV DNA疫苗含有preS2＋S基因的真核表達載體質(zhì)粒，不僅能誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，還能誘導(dǎo)細胞免疫反應(yīng)，從而打破機體因HBV長期感染所引起的免疫耐受，改善機體內(nèi)環(huán)境，恢復(fù)或重建機體的特異性免疫功能，在治療慢性乙型肝炎方面具有廣闊的臨床應(yīng)用前景[1]。原有的發(fā)酵工藝[2]雖能產(chǎn)出足夠量的質(zhì)粒用于下游的質(zhì)粒提取純化，但由于單位菌量內(nèi)質(zhì)量含量不高，增加了下游的純化負擔(dān)和成本，有必要為此進行改進以適應(yīng)臨床Ⅲ期和上市后的用量需求。本文利用產(chǎn)生饑餓效應(yīng)的策略對發(fā)酵培養(yǎng)工藝進行了優(yōu)化，在質(zhì)粒產(chǎn)量和單位菌量質(zhì)粒含量等方面取得顯著所改進?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料

工程菌DH5 α/pS2S，拜迪公司保存；酵母粉（Yeast Extract）、胰蛋白胨（Tryptone）購自O(shè)XOID公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒，購自QIAGEN公司；紫外可見分光光度計，日本日立公司UV-300型。甘油（Glycerol）、氯化鈉（NaCl）、葡萄糖（Glucose）、檸檬酸（Citric acid）、硫酸銨[（NH4）2SO4]、硫酸鎂（MgSO4）、磷酸鹽（Na2HPO4、KH2PO4）等均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 培養(yǎng)基的篩選按表1配制培養(yǎng)基，分裝至50ml三角錐瓶中（20ml/瓶），滅菌后添加氨芐西林至100μg/ml。其中，配方I、Ⅱ、Ⅲ來源于已有工藝[2]。其后，于LB培養(yǎng)基中加入瓊脂（15g/l），鋪平皿，接種工程菌，于37℃培養(yǎng)過夜。挑單個菌落，接種于5ml LB（含AMP100μg/ml）中，37℃振蕩培養(yǎng)至A600為0.6時，分別取菌液200μl接種到各培養(yǎng)基中按預(yù)設(shè)的培養(yǎng)參數(shù)進行培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后分析收菌量（濕菌重）、質(zhì)粒含量（mg/l），并計算單位濕菌中質(zhì)粒含量。

2.2 發(fā)酵方法

2.2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基為篩選到的優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵采用Fed-batch模式，發(fā)酵罐50l（德國B.Braun公司產(chǎn)品），發(fā)酵培養(yǎng)基按具體實施例配方表1配制，配40l，發(fā)酵罐原位滅菌后備用。補料培養(yǎng)基配方為：酵母提取物100g/l，甘油400ml/l。共配10l，滅菌備用。

2.2.2 工藝過程

2.2.2.1 搖瓶培養(yǎng)用凍存菌種接種于搖瓶培養(yǎng)基中，37℃劇烈振蕩16hr至對數(shù)生長期（A600為0.8）。取400ml菌液接種到發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中，開始進行批式補料（Fed-batch）模式的發(fā)酵培養(yǎng)。

2.2.2.2 Batch階段接種后首先為Batch階段。在批式階段（Batch phase），溫度控制在35℃；通過補加10%濃氨水溶液控制PH值在7.0；DO2控制在30%左右，開始階段攪拌速度設(shè)為200r/min，通氣量為70 l/min。當(dāng)DO2水平低于閾值28%時，攪拌速度增加10r/min以促使DO2控制在30%，在批式階段攪拌速度最高值設(shè)為350r/min。在批式階段后期由于氧供應(yīng)不足DO2將會下降，最低至2%左右。批式階段末期營養(yǎng)組分將消耗盡，此時工程菌代謝將趨于停止，DO2值將在短期內(nèi)躍升，當(dāng)DO2達到15%時。發(fā)酵開始進入補料階段（Feeding phase）。

2.2.2.3 補料階段發(fā)酵溫度升至37℃；DO2值依然控制在30%左右，當(dāng)DO2值低于30%時攪拌速度以10r/min的增幅增加，直至達到最高轉(zhuǎn)速（700r/min）；在補料階段，當(dāng)DO2值高于50%、PH值高于7.2時表明生長限制性的碳源缺失，此時按預(yù)設(shè)的補料速度進行補料（補料值為4ml/min），直到DO2值低于50%或PH值低于7.2時停止補料；在補料階段，通氣量保存不變，當(dāng)攪拌速度達到最高轉(zhuǎn)數(shù)時，DO2因供氧矛盾而趨于下降，當(dāng)DO2趨于0值時停止發(fā)酵。

2.3 分析方法質(zhì)粒含量和純度的測定：采用核酸測定含量，并進行1%瓊脂糖凝膠電泳，上樣量為1μg。經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)掃描，分析超螺旋（SC）質(zhì)粒的比例[3]。

3 結(jié)果

3.1 培養(yǎng)基的篩選培養(yǎng)基搖瓶篩選實驗表明，配方IV配制的培養(yǎng)基培養(yǎng)表達的質(zhì)粒DNA單位含量明顯高于其它配方的結(jié)果（見表2）。確定配方IV為發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

3.2 發(fā)酵結(jié)果按2.2的方法進行連續(xù)三批（Lot 1001、Lot 1002與Lot 1003）的發(fā)酵。發(fā)酵收獲液的檢測結(jié)果表明，與原有工藝的發(fā)酵批次相比，改進工藝的發(fā)酵批在單位發(fā)酵體積質(zhì)粒含量方面提高了1倍，在單位菌量的質(zhì)粒含量提高了70%以上（見表3）。

表1 待篩選的培養(yǎng)基配方

表2 DH5α/pS2S工程菌在不同配方培養(yǎng)基的搖瓶發(fā)酵結(jié)果

表3 不同發(fā)酵工藝條件下DH5α/pS2S工程菌發(fā)酵結(jié)果比較(±s)

表3 不同發(fā)酵工藝條件下DH5α/pS2S工程菌發(fā)酵結(jié)果比較(±s)

注：*與原有工藝相比，差異十分顯著（P＜0.01）

工藝來源 發(fā)酵批次 發(fā)酵結(jié)束時A600單位體積收菌量(g/l)單位體積質(zhì)粒含量(mg/l)單位菌量質(zhì)粒含量(mg/g,bacteria)原有工藝 3 45.20±5.30 60.50±2.36 82.67±13.24 1.37±0.24改進工藝 3 60.00±6.20 127.08±3.08*304.99±31.06*2.40±0.31*

而根據(jù)Lot 1001批的在線檢測結(jié)果繪制的圖譜可以看出：單位發(fā)酵體積的質(zhì)粒含量隨著發(fā)酵時間而逐漸增加，在發(fā)酵結(jié)束時達到最大值；單位菌量的質(zhì)粒含量在批式培養(yǎng)階段總體亦呈增加趨勢，但在后期由于營養(yǎng)物耗竭而有所下降。而在進入溶氧反饋調(diào)節(jié)為特征的限制性補料階段后（約在發(fā)酵第12小時開始），單位菌量的質(zhì)粒含量在短時間內(nèi)有了顯著增長。此后增長趨勢一直維持至發(fā)酵結(jié)束（見圖1）。

圖1 DH5α/pS2S工程菌發(fā)酵過程中菌體生長的質(zhì)粒表達量圖譜

瓊脂糖凝膠電泳表明，三批發(fā)酵批收獲液中質(zhì)粒超螺旋比例檢測結(jié)果均在95%以上，達到了HBV DNA發(fā)酵相關(guān)質(zhì)量標準（見圖2）。

圖2 三批改進工藝生產(chǎn)的DH5α/pS2S工程菌發(fā)酵純化質(zhì)粒瓊脂糖凝脈電泳圖譜

4 討論

攜帶有外源基因的質(zhì)粒DNA為基因治療和DNA疫苗研究開發(fā)中使用的主要藥物載體。目前，治療性的質(zhì)粒DNA臨床用量已達到了mg級，因此大量制備的質(zhì)粒DNA需要工業(yè)規(guī)模的大腸桿菌工程菌發(fā)酵技術(shù)來制備。在發(fā)酵策略方面，為了提高細菌發(fā)酵密度，與重組蛋白工程菌發(fā)酵工藝相似，現(xiàn)有的質(zhì)粒DNA發(fā)酵工藝普遍采用補料-分批發(fā)酵（Fed-batch）的方法進行，即在發(fā)酵過程中基礎(chǔ)培養(yǎng)基碳源、氮源等營養(yǎng)成分衰竭時，通過恒速或指數(shù)型流加補料的方式提高菌體生長密度和目標產(chǎn)物的表達總量[5-7]。

到目前為止，現(xiàn)有文獻公開的質(zhì)粒DNA工程菌發(fā)酵工藝目標主要以提高質(zhì)?？偖a(chǎn)量為目標。而良好的質(zhì)粒DNA發(fā)酵工藝除了能生產(chǎn)較高的質(zhì)粒DNA總量外，還能提高單位菌量內(nèi)的質(zhì)粒DNA含量以適應(yīng)下游純化工藝的需求。

在本研究中發(fā)現(xiàn)，在非工程菌最佳生長的限制性條件下（如限制供應(yīng)碳源、氮源或溶氧量、較低的生長溫度等），菌體趨向于將營養(yǎng)底物轉(zhuǎn)化成質(zhì)粒，從而提高單位菌量的質(zhì)粒拷貝數(shù)，此即為菌體的生長限制效應(yīng)。本文中的發(fā)酵工藝改進思路為：首先通過配方篩選得出能提高單位菌量質(zhì)粒含量的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在此基礎(chǔ)上，在分批發(fā)酵階段采用較低的生長溫度以進一步提高菌體的質(zhì)?？截悢?shù)水平。在隨后的補料階段，則采用溶氧反饋調(diào)節(jié)的限制性補料方式以獲得高拷貝質(zhì)粒的菌體。在線檢測和最終發(fā)酵收獲液檢測結(jié)果證明了改進后的發(fā)酵工藝不僅增高了質(zhì)粒總產(chǎn)量，還顯著提高了單位菌量的質(zhì)粒含量。以上改進為治療性雙質(zhì)粒HBV DNA疫苗的規(guī)?；a(chǎn)奠定了堅實的基礎(chǔ)。

[1]Yang S., Lee C., Park S., et al.Correlation of antiviral T cell response with suppression of viral rebound in chronic hepatitis B carries：a proof-of-concept study[J].Gene Therapy, 2007,13(14)：1110-1117.

[2]饒桂榮,黃英,王鵬.治療性雙質(zhì)粒HBV DNA疫苗工程菌的中試發(fā)酵工藝研究[J].中國生物制品學(xué)雜志,2007,20(2)：110-113.

[3]Sambrook J., Fritsch E., Maniais T.Molecular cloning：a laboratory manual.2nd edition[M].New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989：880-885.

[4]Michael K., Gareth M.Growth Medium Selection and Its Economic Impact on Plasmid DNA Production [J].Journal of Bioscience And Bioengineering,2007,104(6)：490-497.

[5]Kevin O.,Ruth F., Frank H., et al.Strategies for high titre plasmid DNA production in Escherichia coli DH5α[J].Process Biochemistry, 2007,42：1039-1049.

[6]Heather A., Chen N.Enhanced High Copy Number Plasmid Maintenance and Heterologous Protein Production in an Escherichia coli Bio film [J].Biotechnology and Bioengineering, 2007,97(3)：439-446.

[7]Filomena S.Plasmid fermentation strategies：influence on plasmid stability and cell physiology[J].Appl Microbiol Biotechnol, 2012,93：2571-2580.

Optimization of HBV DNA Plasmid Fermentation Process by the Strategy of Bacterial Growth Limitation

Zhang Mingsen Qiu Ligong Wei Jian Wang Canding Huang Ming

ObjectiveTo optimization of HBV DNA plasmid fermentation process.MethodsThe composition of batch medium was determined to increase plasmid copy number per bacteria by shaking flask test.In the fed-batch phase of 40l fermentation,the plasmid copy number was further increased by growth limitation strategy which is characterized by DO2feedback feeding control.ResultsBy using the optimized fermentation process,plasmid content from the fermentation harvest reached 304.99mg/l or 2.40mg/g bacteria,and the proportion of supercoiled plasmid DNA was higher than 95%.ConclusionThe fermentation process was developed,with high copy number of plasmid both per liter and per bacteria.It laid a foundation of industrial scale production of the therapeutic HBV DNA vaccine.

Therapeutic HBV DNA vaccine; Recombinant engineered bacteria; Fermentation; Growth limitation

R392

A

1673-5846(2013)08-0027-03

廣州白云山拜迪生物醫(yī)藥有限公司，廣東廣州 511495

廣東省2012年重大科技專項（重要新藥創(chuàng)制）計劃項目（2012A080204009）

張明森，制藥工程師，電話：13802930361；E-Mail：13380009138@139.com。

丘力功，電話：13660769433；E-Mail：007qiu@21cn.com。