宋燦輝，張偉國(guó)

（江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫214122）

敲除ace E基因?qū)Υ竽c桿菌生長(zhǎng)和丙酮酸代謝的影響

宋燦輝，張偉國(guó)

（江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫214122）

大腸桿菌ace E基因是編碼丙酮酸脫氫酶多酶復(fù)合體PdhR的關(guān)鍵酶之一。利用Red重組系統(tǒng)敲除大腸桿菌MG1655的ace E基因后，阻斷了丙酮酸流向TCA循環(huán)，導(dǎo)致丙酮酸的累積，也使菌體生長(zhǎng)受到影響，在培養(yǎng)基中補(bǔ)加5 g／L KAc后可以在一定程度上彌補(bǔ)菌株在生長(zhǎng)上的缺陷。搖瓶發(fā)酵36 h，MG1655沒有積累丙酮酸，MG1655Δace E∷cat菌株可以積累26.77 g／L丙酮酸，為利用大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸奠定了基礎(chǔ)。

ace E；大腸桿菌；丙酮酸；Red重組

丙酮酸是一種重要的有機(jī)中間體，在化工、制藥和農(nóng)用化學(xué)品等工業(yè)及科學(xué)研究中有著廣泛的用途［1］。丙酮酸是機(jī)體代謝的中間產(chǎn)物，處于糖酵解途徑的末端，同時(shí)又連接著己糖磷酸途徑（EMP）和三羥酸循環(huán)（TCA），處于代謝途徑中的關(guān)鍵代謝支點(diǎn)，在細(xì)胞中很容易代謝為其他產(chǎn)物，難以積累，只有切斷或弱化丙酮酸的進(jìn)一步代謝，才能達(dá)到使其在細(xì)胞中積累并分泌到胞外的目的［2］。丙酮酸脫氫酶（PDH）多酶復(fù)合體包含了3種酶：丙酮酸脫氫酶（E1p）、二氫硫辛酰轉(zhuǎn)乙酰基酶（E2p）和二氫硫辛酸脫氫酶（E3）。其中，ace E、ace F和lpd A分別編碼這3種蛋白［3］。當(dāng)敲除ace E后，PDH失去將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰CoA的能力，中心代謝途徑因?yàn)闆]有足量的乙酰CoA供應(yīng)而出現(xiàn)障礙，但是在培養(yǎng)基中添加一定量的乙酸鹽，菌體可以利用乙酸鹽合成乙酰CoA，從而可以彌補(bǔ)生長(zhǎng)上的不足［4］，并開始積累丙酮酸。

目前，用于丙酮酸生產(chǎn)的菌株有酵母、放線菌和細(xì)菌［2］。工業(yè)化生產(chǎn)所用菌株主要是酵母，其中以球擬酵母的研究和應(yīng)用最多，發(fā)酵所用酵母都為維生素等多種營(yíng)養(yǎng)缺陷性，培養(yǎng)基配制比較復(fù)雜，且發(fā)酵溫度較低，一般在30℃左右，發(fā)酵周期為60 h［5-6］。大腸桿菌最適培養(yǎng)溫度為37℃，具有發(fā)酵溫度高和繁殖速度快等優(yōu)點(diǎn)。利用大腸桿菌產(chǎn)丙酮酸的策略是阻斷丙酮酸進(jìn)入TCA循環(huán)，如敲除lpd A基因可以積累一定量的丙酮酸［7-8］。本文中筆者主要考察敲除大腸桿菌MG1655的ace E基因?qū)w生長(zhǎng)和產(chǎn)丙酮酸的影響，以期獲得高產(chǎn)丙酮酸的大腸桿菌菌株，為選育產(chǎn)丙酮酸的工業(yè)化生產(chǎn)菌株奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌MG1655（E．coli str.K-12 substr. ATCC 47076）、質(zhì)粒pKD46和pKD3由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 試劑

L-阿拉伯糖、氨芐青霉素（Amp）、氯霉素（Cm）、瓊脂糖、Tris、SDS、膠回收試劑盒和基因組提取試劑盒，上海生工；Primix Ex Taq、Dpn I、DL 15 000和DL 10 000，TaKaRa（大連）公司；蛋白胨、酵母膏，Difico公司；葡糖糖為食品級(jí)，NaCl、（NH4）2SO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·5H2O、NaOH、KAc、KCl、MgCl2和CaCl2均為市售國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

LB培養(yǎng)基（1 000 mL）：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g；pH 7.0。

SOB培養(yǎng)基（1 000 mL）：蛋白胨20 g，酵母膏5 g，NaCl 0.5 g，1 mol／L KCl 2.5 mL；pH 7.0。滅菌后，加入1 mol／LMgCl220 mL。

SOC培養(yǎng)基（1 000 mL）：蛋白胨20 g，酵母膏5 g，NaCl 0.5 g，1 mol／L KCl 2.5 mL；pH 7.0。滅菌后，加入1 mol／LMgCl210 mL，1 mol／L葡萄糖20 mL。

搖瓶種子培養(yǎng)基（1 000 mL）：葡萄糖25 g，（NH4）2SO415 g，KH2PO41 g，酵母膏2 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，MnSO4·5H2O 0.01 g，KAc 5 g，CaCO340 g。用NaOH調(diào)pH 7.0，121℃滅菌20min。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基（1 000 mL）：葡萄糖40 g，（NH4）2SO416 g，KH2PO41 g，酵母膏2 g，MgSO4·7H2O 1 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，MnSO4·5H2O 0.01g，KAc 5 g，CaCO340 g。用NaOH調(diào)pH 7.0，121℃滅菌20min。

搖瓶發(fā)酵：裝液量為25 mL（500 mL搖瓶）；用接種環(huán)取兩環(huán)MG1655Δace E∷cat在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，按8%的接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)36 h后，葡萄糖消耗完，發(fā)酵結(jié)束。

大腸桿菌培養(yǎng)條件37℃、100 r／min；氨芐青霉素使用終質(zhì)量濃度100μg／mL、氯霉素使用終質(zhì)量濃度25μg／mL；需要添加KAc時(shí)，加入量為5 g／L；相應(yīng)固體培養(yǎng)基中添加20 g／L的瓊脂。

1.4 丙酮酸測(cè)定方法

取適當(dāng)發(fā)酵液，稀釋100倍后，10 000 r／min離心5 min，上清經(jīng)0.22μm濾膜過濾，采用HPLC測(cè)定其中丙酮酸含量。DIONEXP680型色譜儀（美國(guó)戴安公司）：色譜柱Kromasil100-5 C18250mm×4.6mm；流動(dòng)相水（含0.02 mol／L KH2PO4）和乙腈，兩者體積比為90∶10；流速0.6 mL／min；進(jìn)樣量10μL；紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；柱溫25℃。

1.5 ace E的敲除

將pKD46（Amr）化轉(zhuǎn)MG1655，涂布氨芐平板，在30℃培養(yǎng)12 h后，挑取單菌轉(zhuǎn)接液體LB，于30℃培養(yǎng)12 h。取1 mL培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接于100 mL新鮮液體LB中（Amp 100μg／mL，L-阿拉伯糖10mmol／L），于30℃培養(yǎng)。當(dāng)菌液OD600為0.2時(shí)，將L-阿拉伯糖濃度調(diào)為30 mmol／L，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.6，將菌液冰浴20 min，4 000 r／min、4℃離心10 min收集菌體，用預(yù)冷的10%甘油洗滌4次后，將菌體濃縮為1 mL感受態(tài)細(xì)胞，50μL分裝，于-20℃保存。

打靶片段M ace E的獲得：用引物M ace E?F、M ace E?R以pKD3為模板，PCR擴(kuò)增出打靶片段M ace E，用Dpn I隔夜消化模板后，膠回收，最后用滅菌雙蒸水洗脫。

電轉(zhuǎn)化體系：50μL感受態(tài)細(xì)胞和10μLM ace E輕柔混勻后，加入電擊杯，冰浴10 min。

電轉(zhuǎn)化條件：1 mm電擊杯，1 800 V，5 ms，25 μF，200Ω。

電轉(zhuǎn)化后，立即加入1 mL預(yù)熱至37℃的SOC（含有5 g／L KAc），37℃復(fù)蘇2 h，離心收集菌體后，濃縮為200μL，涂布于2個(gè)SOB平板（25μg／mL Cm，20 mmol／L MgCl2，5 g／L KAc）。于37℃培養(yǎng)16 h后，挑取陽性轉(zhuǎn)化子于SOB平板并用鑒定引物ace E?F和ace E?R進(jìn)行菌落PCR，鑒定M ace E是否重組到ace E中。將菌落PCR鑒定正確的單菌，切膠回收Δace E片段，進(jìn)行測(cè)序。

表1 Red重組所用的引物Table 1 O ligonucleotides used for Red recombination

表2 擴(kuò)增M ace E的反應(yīng)體系和條件Table 2 PCR protocol and program for am p lification of M ace E

表3 擴(kuò)增ace E和Δace E∷cat的反應(yīng)體系和條件Table 3 PCR protocol and program for am plification of ace E andΔace E∷cat

pKD46的去除：將測(cè)序正確的菌落接于LB（Cm 25μg／mL，KAc 5 g／L）中，于42℃培養(yǎng)12 h后，在氯霉素抗性平板上劃線培養(yǎng)，將長(zhǎng)出的單菌分別點(diǎn)在氯霉素抗性和氨芐抗性的平板。挑取在氯霉素抗性平板長(zhǎng)，在氨芐抗性板上不長(zhǎng)的菌即為去除pKD46的MG1655Δace E∷cat。

2 結(jié)果與討論

2.1 ace E基因的敲除

利用Red重組系統(tǒng)，成功將ace E基因敲除并鑒定，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知：用鑒定引物擴(kuò)增MG1655基因組，能擴(kuò)增出2 800 pb條帶；擴(kuò)增MG1655Δace E∷cat能擴(kuò)增出1 226 bp條帶。將擴(kuò)增出的1 226 bp條帶進(jìn)行膠回收，送往上海生工進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示Cm抗性基因cat成功替換掉了ace E基因。

圖1 利用pKD3敲除ace E的PCR鑒定Fig.1 PCR verification of ace E knockout in MG1655

2.2 KAc對(duì)MG1655和MG1655Δace E∷cat生長(zhǎng)的影響

在LB培養(yǎng)基中分別添加0、5、10、15和20 g／L KAc，取MG1655和MG1655Δace E∷cat的隔夜培養(yǎng)物500μL轉(zhuǎn)接于50 mL LB，培養(yǎng)12 h，每隔2 h測(cè)定600 nm處的吸光值，繪制生長(zhǎng)曲線見圖2和圖3。

圖2 KAc添加量對(duì)MG1655的影響Fig.2 Effects of different KAc concentration on MG1655 grow th

由圖2可以看出：添加KAc使MG1655的對(duì)數(shù)期延遲，隨著添加量的增大，進(jìn)入對(duì)數(shù)期越晚；添加5 g／L的KAc和不添加KAc的對(duì)數(shù)期一致，說明5 g／L KAc的添加量對(duì)菌體生長(zhǎng)幾乎沒有抑制作用；添加5、10、15和20 g／L KAc后，菌體的生物量分別比未添加KAc增加了15.1%、20.9%，23.4%和18.9%，說明菌體利用乙酸鹽作為C源，有助于生物量的增加。

圖3 KAc添加量對(duì)MG1655Δace E∷cat生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effects of different KAc concentrations on MG1655Δace E∷cat grow th

由圖3可知：ace E的缺失，造成丙酮酸不能進(jìn)入TCA循環(huán)，使中心代謝途徑出現(xiàn)嚴(yán)重障礙，生長(zhǎng)緩慢。在添加5 g／L KAc后，在4 h后才進(jìn)入對(duì)數(shù)期，與圖2結(jié)果相比，比MG1655的對(duì)數(shù)期延遲了約2 h；未添加KAc，菌體在8 h后也出現(xiàn)增長(zhǎng)，可能是菌體利用接種的500μL過夜培養(yǎng)物中的少量KAc的緣故。

2.3 MG1655Δace E∷cat的搖瓶發(fā)酵結(jié)果

經(jīng)過36 h的搖瓶發(fā)酵，葡萄糖耗盡，取發(fā)酵液測(cè)定丙酮酸的含量。圖4為MG1655和MG1655Δace E∷cat發(fā)酵液中的丙酮酸HPLC分析結(jié)果。由圖4可知：MG1655發(fā)酵液中未檢測(cè)到丙酮酸，而MG1655Δace E∷cat發(fā)酵液中含有丙酮酸。經(jīng)測(cè)定，MG1655Δace E∷cat發(fā)酵液中丙酮酸含量為26.77 g／L。

3 結(jié) 論

ace E基因的敲除對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)有嚴(yán)重的負(fù)面影響，需在培養(yǎng)基中添加5 g／L的KAc以維持生長(zhǎng)；MG1655和MG1655Δace E∷cat在40 g／L葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h后，MG1655不產(chǎn)丙酮酸，MG1655Δace E∷cat產(chǎn)丙酮酸為26.77 g／L，對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)化率為0.67 g／g。

在后期的研究中，可以對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的葡萄糖、玉米漿、（NH4）2SO4和CaCO3的濃度及接種量進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化，以實(shí)現(xiàn)丙酮酸的進(jìn)一步積累。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)品及MG1655和MG1655Δace E∷cat發(fā)酵液HPLC分析圖譜Fig.4 HPLC standard m ixture and fermentation sam ples of MG1655 and MG1655Δace E∷cat

［1］ 張宗祥.采用微生物發(fā)酵制取丙酮酸的研究［D］.南京：南京理工大學(xué)，2004.

［2］ 劉立明，李寅，堵國(guó)成.生物技術(shù)法生產(chǎn)丙酮酸的研究進(jìn)展［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2002，18（6）：651?655.

［3］ Ogasawara H，Ishida Y，Yamada K，et al.PdhR（pyruvate dehydrogenase complex regulator）controls the respiratory electron transport system in Escherichia coli［J］.J Bacteriol，2007，189（5）：5534?5541.

［4］ 翁志明.用代謝工程構(gòu)建高產(chǎn)番茄紅素大腸桿菌［D］.廣州：中山大學(xué)，2010.

［5］ Liu L M，Li Y，Du G C，et al.Breeding of high?pyruvate?producing Torulopsis glabrata with acetate as supplement catbon source［J］.Ind Microbiol，2002，32（3）：21?26.

［6］ 楊松鑫，王蒙，汪軍.基于光滑球擬酵母環(huán)境適應(yīng)性的丙酮酸中試條件優(yōu)化［J］.過程工程學(xué)報(bào)，2011，11（6）：1044?1049.

［7］ 李邁.不同碳源及通氣條件下lpd A基因敲除對(duì)大腸桿菌代謝的影響［J］.化工學(xué)報(bào)，2006，57（4）：880?885.

［8］ 王佶.大腸桿菌積累丙酮酸的研究［D］.杭州：浙江大學(xué)，2008.

Effects of ace E gene knockout on grow ing and pyruvate biosynthesis of E．coli

SONG Canhui，ZHANGWeiguo

（Key Laboratory of Industrial Biotechnology of the Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

Gene ace E encodingwas one of the key enzymes of pyruvate dehydrogenase complex regulator. Using Red recombination，the gene ace E of E．coli MG1655 was knockouted to block the pyruvate flow TCA cycle，causing pyruvate accumulation and growth deficiency.The medium supplemented with 5 g／L KOAc could make up the growth defect to a certain extent strains.MG1655Δace E∷cat in shake flask fermentation for 36 h could produce pyruvate with 26.77 g／L，initial strain MG1655 did not produce pyruvate.

ace E；E．coli；pyruvate；Red recombination

Q814

A

1672-3678（2013）06-0015-04

10.3969／j.issn.1672-3678.2013.06.003

2012-08-12

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）（2008AA02Z212）

宋燦輝（1986—），男，河南洛陽人，碩士研究生，研究方向：基因工程；張偉國(guó)（聯(lián)系人），教授，E?mail：zhangwg168＠126.com