許 峰 查長春

（1 復旦大學 生命科學學院，上海 200433；2 江蘇省弗泰生物科技有限公司，江蘇 泰州 225316）

火棘果紅色素提取物的體內免疫活性研究

許 峰1查長春2

（1 復旦大學 生命科學學院，上海 200433；2 江蘇省弗泰生物科技有限公司，江蘇 泰州 225316）

目的研究火棘果紅色素提取物對環(huán)磷酰胺所致免疫低下模型小鼠免疫功能的調節(jié)作用，為其在畜牧養(yǎng)殖中的應用提供理論依據(jù)。方法采用腹腔注射環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）復制免疫功能低下小鼠模型，并考察不同劑量火棘果紅色素提取物對免疫抑制小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、腹腔吞噬細胞吞噬功能、血清溶血素生成及溶血空斑形成的影響。結果火棘果紅色素提取物中、高劑量組能顯著提高免疫功能低下小鼠的臟器指數(shù)，增強腹腔巨噬細胞吞噬功能，促進溶血素水平及溶血空斑的形成。結論火棘果紅色素提取物具有良好的免疫活性。

火棘果紅色素提取物；體內；免疫活性

本研究選用中藥火棘為研究對象，研究火棘果紅色素提取物對小鼠免疫活性的影響，進而為火棘果在畜禽飼養(yǎng)中的疾病防治應用提供理論依據(jù)。火棘（Pyracantha fortuneana）為薔薇科蘋果亞科火棘屬常綠野生灌木或小喬木果樹植物，是一種豐富的天然資源，在湖南、河南、陜西、四川等地分布廣，產(chǎn)量大?；鸺粌H營養(yǎng)豐富、具有很高的食用價值，火棘的根、皮、葉、果具有“生津止渴、清熱解毒、收斂止瀉”的功效，其果用于療瘡毒、治陰虛、止瀉痢等藥用功效早已被民間所證實?；鸺t色素是從天然火棘果中提取而得，屬花青素類?；ㄇ嗨卮蠖嗌珴甚r艷，不僅具有較好的著色效果，而且無毒無誘變作用，除作為食品、化妝品的著色劑外，它還具有抗氧化、抑制癌細胞入侵、抗炎抗病毒、保護肝臟、心腦血管以及神經(jīng)系統(tǒng)等多種藥理活性[1-2]。研究表明，火棘果紅色素具有清除自由基活性[3]，體內免疫活性與抗氧化作用密切相關，火棘果紅色素體內抗免疫活性的研究未見報道，本文系統(tǒng)研究了火棘果紅色素提取物體內免疫活性，為火棘果的應用開發(fā)奠定研究基礎。

1 材 料

1.1 儀器

UV-2802型紫外—可見分光光度計（尤尼柯（上海）儀器有限公司）；JJ500型精密電子天平（美國雙杰克兄弟（集團）有限公司ā常熟雙杰測試儀器廠）；TA25組織勻漿機（IKA）；101-1數(shù)顯電熱鼓風干燥箱（上海浦東躍進醫(yī)療器械廠）；RE-5299型旋轉蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限責任公司）；HH-S型水浴鍋（鞏義市予華儀器廠）；BH-2型顯微鏡（Olympus）；TGL-16G臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；ALPHA2-4LSC冷凍干燥機（christ）。

1.2 試劑

火棘果（泰州職業(yè)技術學院校園內采集）；環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批號為11051022，英文縮寫為CTX）；生理鹽水（徐州第五制藥廠生產(chǎn)，批號為2011020701）；肝素鈉注射液（江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，2mL：2500單位）；95%醫(yī)用級酒精；其余試劑均為分析純。

1.3 動物

清潔級昆明種小鼠，雌雄各半，體質量18～22g（上海斯萊克實驗動物有限責任公司），生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2002-0010號；豚鼠：健康豚鼠；雞：健康家雞。

2 方 法

2.1 火棘果紅色素提取物的提取[1,3]

取干燥火棘果10克，用90mL70%的酸性乙醇溶液，pH=3在40℃水浴中提40min，提取3次，抽濾合并后的到紅色提取液，將提取液在50℃下用旋轉蒸發(fā)器濃縮得火棘果紅色素提取物浸膏，50℃干燥得深紅色固體提取物，即為火棘果紅色素提取物。按下公式計算火棘果紅色素提取物提取得率：火棘果紅色素提取物得率（%）=提取物質量（g）/干果質量（g）×100%。

2.2 火棘果紅色素提取物免疫活性測定

2.2.1 雞紅細胞懸液的制備[4]

取新鮮雞血約10mL，以肝素生理鹽水抗凝，加入生理鹽水10mL，充分混勻，1500r/min離心15min，沉淀層紅細胞加入生理鹽水10mL，洗滌2～3次。用生理鹽水將洗凈的紅細胞配制成5%（v/v）濃度，臨用前配制。

2.2.2 豚鼠血清補體制備

分別取5只不同窩豚鼠的血，分離后合并血清，用生理鹽水把血清配成10%（v/v），備用。

2.2.3 小鼠分組、造模及給藥[5-7]

將小鼠隨機分為5組，每組10只，雌雄各半，分為正常組、模型組和給藥組（火棘果紅色素高、中、低劑量組）。正常組每天灌胃生理鹽水0.4mL和腹腔注射生理鹽水0.4mL，模型組每天灌胃生理鹽水0.4mL和腹腔注射CTX20mg/kg，各給藥組分別灌胃給藥不同濃度的火棘果紅色素提取物溶液0.4mL（高、中、低劑量分別為800、400、200mg/kg）同時腹腔注射CTX 20mg/kg。

2.2.4 測定臟器指數(shù)[8]

按照“2.2.3”項下的方法，不間斷給藥7d，把小鼠脫頸椎致死，在無菌條件下，將脾臟、胸腺器官剝取，然后稱定質量，按照公式（1）計算臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)/（mg/g）=器官質量/體質量（1）

2.2.5 測定腹腔巨噬細胞的吞噬功能[9]

按照“2.2.3”項下方法：分組、造模和給藥，7d后，分別給小鼠在腹腔部位注射5%的雞紅細胞生理鹽水懸液0.5mL（質量份數(shù)）進行免疫，10h后處死小鼠，將腹部皮膚剪開，用2mL生理鹽水注射沖洗腹腔，將沖洗液滴于2片載玻片上，放入托盤內，30min恒溫孵育（37℃），用生理鹽水除去沒有被吞噬的雞紅細胞和其他細胞，吹干，并用甲醇/丙酮（1∶1）溶液固定5min，晾干，瑞氏染液染色，油鏡下觀察，計數(shù)100個吞噬細胞，按式（2）、（3）計算巨噬細胞吞噬率及吞噬指數(shù)。

吞噬率（%）=（吞有雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)/巨噬細胞總數(shù)）× 100%（2）；吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細胞數(shù)/巨噬細胞總數(shù)（3）

2.2.6 測定溶血素水平[9]

按照“2.2.3”項下的方法分組、造模和給藥。第1天給藥，用5%的雞紅細胞混懸液0.2mL給每只小鼠腹腔注射進行免疫。最后一次給藥后40min，采用摘眼球的方法取血、離心，用生理鹽水稀釋血清100倍。將10%的豚鼠新鮮血清0.5mL、5%的雞紅細胞懸液0.5mL和稀釋血清1mL、混勻，37℃保溫30min，在冰水浴中使反應停止，離心，取上清，540nm處測定吸光度（A）值。

2.3 數(shù)據(jù)的處理

采用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計和分析，分析結果都以（χ—±s）表示，組與組間比較采用方差分析和t檢驗。

3 結 果

3.1 火棘果紅色素提取物提取得率

火棘果紅色素提取物的得率為30.1%。

3.2 火棘果紅色素提取物對免疫抑制小鼠免疫器官指數(shù)的影響

與正常組相比，模型組小鼠臟器指數(shù)均顯著降低（P＜0.01），免疫抑制模型造模成功。與模型組相比，火棘果紅色素提取物中、高劑量組對胸腺的保護作用差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；中、高劑量組對脾臟的保護作用差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），表明火棘果紅色素提取物對免疫抑制小鼠免疫器官有良好的保護作用。

3.3 火棘果紅色素提取物對免疫抑制小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響

模型組小鼠腹腔巨噬細胞對雞紅細胞的吞噬指數(shù)和吞噬百分率均低于正常組（P＜0.05），說明成功建立小鼠免疫抑制模型。在和模型組相比的情況下，火棘果紅色素提取物高劑量組能夠明顯提高小鼠腹腔巨噬細胞對雞紅細胞的吞噬指數(shù)和吞噬率（P＜0.05），中、低劑量組提高作用不太大，表明火棘果紅色素提取物對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能有提高作用。

3.4 火棘果紅色素提取物對免疫抑制小鼠體液免疫功能的影響

與正常組相比，模型組溶血素水平顯著下降，表明免疫抑制模型建立成功。與模型組相比，火棘果紅色素提取物中劑量組能顯著促進免疫抑制小鼠溶血素生成（P＜0.05），高劑量組有極顯著性差異（P＜0.01），表明，火棘果紅色素提取物能顯著提高免疫抑制小鼠的體液免疫功能。結果見表1。

表1 火棘果紅色素提取物對免疫抑制小鼠溶血素、溶血空斑形成的影響

4 討 論

本文選用火棘果中的火棘果紅色素提取物為研究對象，研究其對小鼠免疫活性的影響，以期為火棘果的現(xiàn)代應用提供科學依據(jù)。因火棘果紅色素含量測定干擾因素較多，目前沒有比較成熟的含量測定方法，故本文以火棘果紅色素提取物為研究對象，研究其在體內的免疫活性。劑量選擇的依據(jù)：研究表明火棘果紅色素在濃度為1.8mg/mL時具有顯著抗氧化能力[3]，在預實驗的基礎上，本課題體內免疫活性研究采用約10倍濃度作為中等劑量，據(jù)此設計高中低劑量為800mg/mL、400mg/mL和200mg/mL。

本文采用臨床抗腫瘤的基礎藥物環(huán)磷酰胺進行動物機體免疫系統(tǒng)損傷模型試驗，考察了不同劑量火棘果紅色素提取物對環(huán)磷酰胺導致的小鼠免疫功能低下的修復功能。動物的主要免疫器官是胸腺和脾臟，CD4

+T細胞分化和發(fā)育成熟的主要場所是胸腺，而動物進行機體免疫應答的主要場所是脾臟，它們與細胞免疫、體液免疫關系非常密切，胸腺和脾臟的結構、功能的正常運行，對于維護機體的免疫功能非常重要。在本實驗中，環(huán)磷酰胺致小鼠的免疫功能低下模型中，火棘果紅色素提取物中、高劑量均能明顯提高免疫器官的功能；此外，中、高劑量的火棘果紅色素提取物對提高腹腔吞噬細胞的吞噬能力具有顯著作用；高劑量的火棘果紅色素提取物可促進血清溶血素及溶血空斑形成，并呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。表明火棘果紅色素提取物是一種優(yōu)良的免疫調節(jié)劑，故利用火棘果進行疾病防治藥物的研制具有重要的開發(fā)前景。

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R282.710.5

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1671-8194（2013）18-0097-02