羅桂飛 李喜芳 黃志文 張文軍

（廣東藥學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，廣州 廣東 510006）

人工靶向性M1GS核酶胞內(nèi)抗HCV活性的研究

羅桂飛 李喜芳 黃志文 張文軍

（廣東藥學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，廣州 廣東 510006）

目的構(gòu)建對(duì)HCV基因組具有特異切割作用的新型靶向性核酶-M1GS。方法針對(duì)HCV基因組的保守區(qū)(5′UTR)設(shè)計(jì)并合成一段引導(dǎo)序列，通過(guò)PCR擴(kuò)增直接將該引導(dǎo)序列連接于大腸桿菌核糖核酸酶P的催化亞基(M1 RNA)的3′末端，從而構(gòu)建一種靶向性M1GS核酶。結(jié)果胞內(nèi)切割實(shí)驗(yàn)表明，所構(gòu)建的核酶(M1GS-HCV/C76)對(duì)HCV 5′UTR具有明顯的切割作用，切割的位點(diǎn)在靶序列77～89 n t之間，屬于特異性切割，具有胞內(nèi)抗病毒活性。結(jié)論構(gòu)建了一種對(duì)HCV 5′UTR具有靶向切割活性的M1GS核酶，且具有胞內(nèi)抗病毒活性，為動(dòng)物模型內(nèi)抗病毒效應(yīng)的評(píng)價(jià)提供了實(shí)驗(yàn)材料，為新型抗HCV藥物的研究奠定了基礎(chǔ)。

丙型肝炎病毒；5′非編碼區(qū)；核糖核酸酶P；靶向切割

目前全世界大概有1.7億人感染丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV），占世界人口的3%，而我國(guó)約有4千萬(wàn)HCV攜帶者，平均感染率高達(dá)3.2%。雖然急性感染階段癥狀輕微，然而高達(dá)70%以上HCV感染者發(fā)展成慢性過(guò)程，轉(zhuǎn)化成慢性率非常高，可能導(dǎo)致慢性活動(dòng)性肝炎和肝硬化，甚至肝細(xì)胞發(fā)生癌變，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康[1]。目前，臨床上治療方法比較單一，普遍采用干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）或者IFN-γ聯(lián)合病毒唑進(jìn)行保守治療，但干擾素治療有其局限性，存在著例如療效差、易產(chǎn)生耐藥性等副作用，且價(jià)格昂貴、復(fù)發(fā)率高等諸多不足之處[2]。所以，人們尋找更加有效治療HCV的藥物及方法尤為迫切。本研究針對(duì)HCV基因組的保守區(qū)（5′UTR）設(shè)計(jì)并合成一段引導(dǎo)序列，設(shè)計(jì)了一段GS序列，并將其共價(jià)連接至M1 RNA的3＇末端，構(gòu)建一種靶向性的新型人工核酶——M1GS核酶。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所構(gòu)建的M1GS核酶（M1GS-HCV/C76）在HCV感染的huh7.5.1細(xì)胞中，該核酶能夠顯著抑制靶基因的表達(dá)及病毒的復(fù)制。說(shuō)明其具有一定的胞內(nèi)抗病毒活性，為HCV的治療研究提供了一條新的行之有效的途徑[3]。

1 材料與方法

1.1 ①菌種及質(zhì)粒：大腸桿菌菌株JM109，購(gòu)自鼎國(guó)生物公司。M1GS-HCV/C167核酶及pcDNA-HCV'UTR重組質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。pFL117質(zhì)粒和pGEM-3Z載體則由暨南大學(xué)周天鴻教授惠贈(zèng)。PcDNA3.1由本實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建并保存。②細(xì)胞培養(yǎng)試劑：DMEM培養(yǎng)基、四季青胎牛血清、胰蛋白酶、DMSO均購(gòu)自威佳公司。PBS由本實(shí)驗(yàn)室自行配制并保存。③細(xì)胞及病毒：人肝臟細(xì)胞系Huh7 .5.1和丙型肝炎病毒JFH-1(武漢大學(xué)吳建國(guó)教授惠贈(zèng)）④轉(zhuǎn)染劑：碧云天Lipofectin2000購(gòu)自杰順公司。⑤載體構(gòu)建主要試劑：DNA Marker DL2000、DNA Marker DL15000、KpnI BamHI、T4 DNA連接酶及Premix Taq酶購(gòu)自TaKaRa。DNA Marker III、微量質(zhì)粒提取試劑盒及DNA片段純化試劑盒購(gòu)自杰順生物公司。酵母提取物、胰化蛋白胨購(gòu)自環(huán)凱微生物科技有限公司。四環(huán)素、氨芐青霉素購(gòu)自杰順公司。丙烯酰胺和N，N’-亞甲丙烯酰胺、SDS、APS、TEMED、HCVcore單抗（鼠源）及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG購(gòu)自威佳公司。

1.2 M1GS的克隆和鑒定

1.2.1 M1GS-HCV/C76原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以KpnI和BamH對(duì)M1GS核酶PCR回收產(chǎn)物和pGEM-3Z載體進(jìn)行雙酶切，恒溫水浴37℃，過(guò)夜，加10×Loading Buffer 2μL終止反應(yīng)，然后用DNA片段純化試劑盒進(jìn)行純化。然后凝膠純化回收。以T4 DNA Ligase將雙酶切的HCV核心基因PCR回收產(chǎn)物和pGEM-3Z載體進(jìn)行連接反應(yīng)，接著制備感受態(tài)細(xì)胞，并將其與連接體進(jìn)混合，進(jìn)行轉(zhuǎn)化，形成重組子。20h后，質(zhì)粒在含氨芐青霉素的LB平板中挑取轉(zhuǎn)化子單菌落，接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床37℃，180r/min過(guò)夜培養(yǎng)，用微量質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒[4]。

1.2.2 核酶M1GS的體外轉(zhuǎn)錄核酶RNA的制備

以BamHI對(duì)PGEM-core質(zhì)粒進(jìn)行單酶切即線性化，37℃反應(yīng)10min，然后用DNA片段純化試劑盒進(jìn)行純化。再以綠豆芽酶對(duì)線性化的PGEM-HCV質(zhì)粒5′進(jìn)行平滑，置于恒溫水浴箱37℃，過(guò)夜，加10×Loading Buffer 2μL終止反應(yīng)，然后用DNA片段純化試劑盒進(jìn)行純化。所獲得的線性質(zhì)DNA作為體外轉(zhuǎn)錄的模板。在T7 RNA聚合酶的催化作用下進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄[5]。轉(zhuǎn)錄方案參照TaKaRa公司的使用說(shuō)明書(shū)。轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物用DNase I消化30 min、苯酚氯仿抽提1次，乙醇沉淀2次，純化產(chǎn)物保存于80%乙醇中備用。

1.2.3 核酶RNA的制備

先利用限制酶BamHI對(duì)M1GS-HCV/C76質(zhì)粒進(jìn)行單酶切，再以綠豆芽核酸酶對(duì)切割產(chǎn)物進(jìn)行末端平移，所獲得的線性質(zhì)DNA作為體外轉(zhuǎn)錄的模板[6]。在T7 RNA聚合酶的催化作用下進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄方案參照TaKaRa公司的使用說(shuō)明書(shū)。轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物用DNase I消化30min、苯酚氯仿抽提1次，乙醇沉淀2次，純化產(chǎn)物保存于80%乙醇中備用。

1.2.4 M1GS-HCV/C76核酶真核表達(dá)載體的構(gòu)建

限制性核酸內(nèi)切酶KpnI和BamHI雙酶切M1GS-HCV/C76質(zhì)粒及pcDNA3.1載體，凝膠回收目的片段，再以T4 DNA Ligase連接經(jīng)雙酶切的M1GS-HCV/C76核酶基因片段及pcDNA3.1載體[7]。構(gòu)建了含M1GS-HCV/C76基因的真核表達(dá)質(zhì)粒:pc-M1GS/C76。

1.2.5 胞內(nèi)抗病毒研究

pc-HCV5'UTR和pc-M1GS/ C76共轉(zhuǎn)染Huh-7.5.1細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分4組，第1、2、3、4組分別為空轉(zhuǎn)染、pcHCV5'UTR、pcM1GS-HCV/ C167及pcM1GS- HCV/C76與pcHCV5'UTR等摩爾比共轉(zhuǎn)染Huh-7.5.1細(xì)胞[8]。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后Western Blot 檢測(cè)HCV核心蛋白的表達(dá)量。在轉(zhuǎn)染后3d，測(cè)定培養(yǎng)細(xì)胞的病毒滴度，評(píng)價(jià)M1GS核酶對(duì)HCV病毒生長(zhǎng)抑制作用。

2 結(jié) 果

2.1 M1GS-HCV/C76核酶及HCV 核心基因真核表達(dá)載體的鑒定

將經(jīng)雙酶切的M1GS DNA片段與經(jīng)雙酶切的pcDNA3.1載體連接、轉(zhuǎn)化，并轉(zhuǎn)化子平板挑取一個(gè)菌落進(jìn)行擴(kuò)增、提取質(zhì)粒，最后應(yīng)KpnI和BamHI對(duì)提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，并行0.8%瓊脂糖電泳進(jìn)行分析，可見(jiàn)載體均可切出大小兩個(gè)片段，大片段如pcDNA3.1 （5427bp）大小相當(dāng)，小片段與M1GS DNA（512bp）相當(dāng)[9]。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 M：DNA kb ladder；1：pcM1GS-HCV/C76重組質(zhì)粒；2：pcM1GS-HCV/C76重組質(zhì)粒KpnI 和 BamHI 雙酶切

2.2 M1GS胞內(nèi)抗病毒研究

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，對(duì)HCV核心蛋白進(jìn)行western blot分析，以GAPDH為內(nèi)參物，表達(dá)M1GS -HCV/C76核酶的細(xì)胞組，如圖2的（A）所示：HCV核心蛋白的表達(dá)水平減少了。確定胞內(nèi)表達(dá)的核酶對(duì)HCV的復(fù)制是否起了抑制作用，我們做了病毒滴度實(shí)驗(yàn)[7]。如圖2（B）我們可以觀察到，在感染1d后，表達(dá)核酶M1GS- HCV/C76的細(xì)胞，HCV病毒RNA的拷貝數(shù)降低，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明構(gòu)建的核酶M1GS-HCV/C76在胞內(nèi)能有效抑制HCV病毒的復(fù)制[8]。

圖2 M1GS在胞內(nèi)對(duì)HCV病毒的抑制（A） Western blot 檢測(cè)HCV核心蛋白。（B）表達(dá)核酶M1GS的huh 7.5.1細(xì)胞的病毒滴度測(cè)定

3 結(jié) 論

本文成功構(gòu)建了該核酶的真核表達(dá)載體M1GS-HCV/C76，將M1GS核酶導(dǎo)入表達(dá)HCV復(fù)制子系統(tǒng)的Huh-7細(xì)胞，通過(guò)半定量RTPCR及Western Blot檢測(cè)M1GS核酶在胞內(nèi)對(duì)靶基因及蛋白表達(dá)的抑制作用，建立了M1GS核酶的胞內(nèi)復(fù)篩系統(tǒng)，以考察其在胞內(nèi)體內(nèi)是否具有抗病毒的效應(yīng)[9]。

M1GS核酶是一種新型的人工核酶，由GS共價(jià)連接到M1 RNA的3′端而成。其既具有M1 RNA的切割功能，又具備GS的引導(dǎo)功能。M1 RNA是E.coli Rnase P的RNA亞單位，能通過(guò)識(shí)別前體tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)而對(duì)其進(jìn)行切割。GS（Guide Sequence）則是與底物mRNA互補(bǔ)結(jié)合的小片段RNA，能引導(dǎo)M1 RNA對(duì)底物的互補(bǔ)區(qū)域進(jìn)行特異切割。研究表明，Rnase P對(duì)靶RNA的切割可由外部引導(dǎo)序列（External Guide Sequences，EGSs）或連接GS序列的大腸桿菌來(lái)源M1 RNA直接介導(dǎo)。

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Determination of the Antiviral Activities of an Artificial M1GS Ribozyme that Targets to the Core Gene of Hepatitis C Virus

LUO Gui-fei, LI Xi-fang, HUANG Zhi-wen, ZHANG Wen-jun

(Department of Pathogen Biology and Immunology, Guangdong Pharmacetical University, Guangzhou 510006, China)

ObjectiveTo construct a targeting ribozyme (M1GS) which is specific to HCV genome.MethodsAccording to the sequence of conservative region (5′UTR) of HCV genome, a guide sequence was designed and synthesized. And then by the PCR method, a kind of targeting ribozyme can be constructed by covalently linking the guide sequence to the 3′terminus ofM1 RNA, the catalytic subunit of Rnase P from Escherichia coli.ResultsThe engineered ribozyme (M1GS-HCV/C76 is targeted to the 5′UTR of HCV genome, and can effectively cleave the substrate RNA segment in vitro. The cleavage is specific and the cleavage site is between 77 n t and 88 n t of the target region.ConclusionThe M1GS-HCV/C76 would be a useful experimental material to further study its cleavage activity in vivo, and can be even used for evaluating its anti-viral effect in the animal model It was believed that this study would markedly facilitate the research of a general gene targeting agent for anti-HCV applications and lay the foundation for developing a new nucleic acid drug of anti-HCV therapy.

HCV; 5′UTR; Rnase P; Targeting cleavage

R512.6+3

B

1671-8194（2013）15-0017-02