張士云 朱瑞麗 高 磊 王彥云 莫爵飛 潘菊華 劉起華 汪 蓮 劉貴建

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院，北京，100053)

軟堅(jiān)消瘤片為中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)方，以中醫(yī)“健脾益氣、解毒散結(jié)”為法配方，具有健脾益氣化痰、解毒軟堅(jiān)散結(jié)等功效，用來(lái)治療乳腺增生、乳腺瘤、乳腺癌、子宮肌瘤、卵巢瘤、神經(jīng)纖維瘤等常見(jiàn)腫瘤，尤其在治療脾虛痰結(jié)證的乳腺良惡性腫塊性疾病，效果較好。鑒于軟堅(jiān)消瘤片治療乳腺良惡性腫塊性疾病的良好作用，本研究擬通過(guò)觀察軟堅(jiān)消瘤片藥物血清對(duì)乳腺癌MCF－7 細(xì)胞色素P450 芳香化酶基因(Cytochrome P450 aromatase，CYP19)、雌激素受體(Estrogen Receptor，ER)mRNA 表達(dá)、細(xì)胞生長(zhǎng)周期及細(xì)胞凋亡的影響，以期探討軟堅(jiān)消瘤片對(duì)乳腺癌細(xì)胞的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物 雌性Wistar 大鼠40只，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，批號(hào):SCXK 京(2009－0007)，飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院動(dòng)物室，在無(wú)特殊病原體(SPF)環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.1.2 細(xì)胞株人乳腺癌MCF－7 細(xì)胞株，來(lái)源于北京市腫瘤防治研究所細(xì)胞庫(kù)。

1.1.3 藥物與試劑 軟堅(jiān)消瘤片由薏苡仁、拳參、北敗醬草、夏枯草等成分組成，由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院藥劑科制劑中心提供，批準(zhǔn)文號(hào):京藥制字Z20063248。細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Annexin Ⅴ－FITC kit)、細(xì)胞周期測(cè)試試劑盒(CycleTest Plus Reagent kit)，均購(gòu)自美國(guó)BD 公司;熒光染料，購(gòu)自美國(guó)ABI 公司;MTS 細(xì)胞增殖試劑盒(promega，Cat#G3582)，購(gòu)于北京利文商貿(mào)有限責(zé)任公司;Trizol 試劑(Qiagen，Cat#15596－018)、Hyclone 胎牛血清，購(gòu)于北京市普京康利科技有限公司;PCR 引物，由上海生工生物有限公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

1.1.4 儀器與設(shè)備 二氧化碳培養(yǎng)箱(MCO－15AC)，SANYO 公司產(chǎn)品;超速低溫離心機(jī)(Centrifuge 5430R)，德國(guó)Eppendorf 產(chǎn)品;流式細(xì)胞儀(FACSCalibur)，美國(guó)BD 公司生產(chǎn);基因擴(kuò)增儀(LightCycler 480Ⅱ)，Roche 公司產(chǎn)品;核酸定量分析儀(NANODROP 2000)，Thermo 公司產(chǎn)品。

表1 PCR 擴(kuò)增引物序列

1.2 藥物血清制備 選用SPF 級(jí)雌性Wistar 大鼠40只，于購(gòu)入1周后按體質(zhì)量分層，隨機(jī)分為治療組、空白對(duì)照組，每組20只。治療組灌服軟堅(jiān)消瘤片浸膏，劑量0.333 g/kg(相當(dāng)于人臨床用量10 倍);空白對(duì)照組給同體積生理鹽水。每日2次，連續(xù)3 d，第4天給藥后1 h，用戊巴比妥鈉腹腔麻醉(40mg/kg)，腹主動(dòng)脈取血，分離血清，將含藥血清和對(duì)照血清于－70℃冰箱中保存。

1.3 檢測(cè)項(xiàng)目與方法

1.3.1 芳香化酶、雌激素受體mRNA 測(cè)定 常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入含藥血清和對(duì)照血清作用24 h 后，收集細(xì)胞提取細(xì)胞RNA。采用熒光染料摻入qRT－PCR 法測(cè)定芳香化酶、雌激素受體mRNA的表達(dá)水平，以相對(duì)定量的方法計(jì)算含藥血清組各指標(biāo)變化情況，重復(fù)3次取均值。選擇TBP 基因作為內(nèi)參基因，根據(jù)ABI 染料標(biāo)準(zhǔn)操作配制反應(yīng)體系。

1.3.2 細(xì)胞周期測(cè)定 取2組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF－7細(xì)胞加入1 mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)液(含hyclone 胎牛血清)，4 mL 動(dòng)物血清(治療和對(duì)照各一組)，作用48 h 后，胰酶消化處理，制成單細(xì)胞懸液，按細(xì)胞周期測(cè)試試劑盒操作程序測(cè)定細(xì)胞周期，擬合細(xì)胞周期各時(shí)相比例。

1.3.3 細(xì)胞凋亡測(cè)定 取2組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF－7細(xì)胞加入1mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)液(含hyclone 胎牛血清)，4mL動(dòng)物血清(治療和對(duì)照各一組)，作用48 h 后，胰酶消化處理，制成單細(xì)胞懸液，按細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒操作程序分析細(xì)胞凋亡比例。

1.3.4 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)種4 000個(gè)細(xì)胞/孔，每孔加入100μL 培養(yǎng)液，7d 連續(xù)培養(yǎng)。每隔24 h 測(cè)定一批，測(cè)定每批前先加入20μLMTS 試劑，避光37 度潮濕孵育2 h 后490 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值。每組測(cè)定4個(gè)孔，取均值。96 孔反應(yīng)板周邊各孔加基礎(chǔ)培養(yǎng)液做保濕孔。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用()表示，各指標(biāo)的表達(dá)差異采用t 檢驗(yàn)，細(xì)胞周期差異采用構(gòu)成比的χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)FCM－7 細(xì)胞芳香化酶、雌激素受體mRNA 表達(dá)的影響 將對(duì)照組各基因表達(dá)水平作為基數(shù)1，藥物血清作用24 h 后治療組與對(duì)照組比較，F(xiàn)CM－7 細(xì)胞芳香化酶和雌激素受體α(ERα)的表達(dá)水平顯著降低，而雌激素受體β(ERβ)的表達(dá)水平無(wú)明顯改變，見(jiàn)表2。

表2 2組細(xì)胞芳香化酶及雌激素受體mRNA 表達(dá)比較(n=3，)

表2 2組細(xì)胞芳香化酶及雌激素受體mRNA 表達(dá)比較(n=3，)

圖1 細(xì)胞周期FCM 圖

2.2 對(duì)FCM－7 細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響 藥物血清作用48 h 后，F(xiàn)CM－7 細(xì)胞的S 期和G2/M 期下降，尤其以G2/M 期為明顯，相應(yīng)的G0/G1 期增加。表明細(xì)胞用藥后DNA 復(fù)制和分裂活動(dòng)減弱，而靜止期及合成前期狀態(tài)的細(xì)胞增多，藥物抑制了細(xì)胞周期的正常進(jìn)行。見(jiàn)表3，圖1。

表3 2組FCM－7 細(xì)胞各周期時(shí)相比較(n=3，，%)

表3 2組FCM－7 細(xì)胞各周期時(shí)相比較(n=3，，%)

2.3 對(duì)FCM－7 細(xì)胞凋亡的影響 藥物血清作用細(xì)胞48 h 后，F(xiàn)CM－7 細(xì)胞早期凋亡率明顯增加，晚期凋亡率有所下降，用藥組總體凋亡率高于對(duì)照組。見(jiàn)表4、圖2。

表4 2組FCM－7 細(xì)胞凋亡情況比較(n=3，)

表4 2組FCM－7 細(xì)胞凋亡情況比較(n=3，)

圖2 細(xì)胞凋亡FCM 圖

2.4 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定 在細(xì)胞培養(yǎng)0～48 h 期間，2組生長(zhǎng)曲線無(wú)明顯差異;而在細(xì)胞培養(yǎng)48 h 以后，治療組的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線幅度開(kāi)始明顯低于對(duì)照組，在96 h 時(shí)抑制效果最明顯，至細(xì)胞培養(yǎng)120 h 以后，治療組的細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用開(kāi)始減弱。見(jiàn)圖3。

圖3 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

3 討論

軟堅(jiān)消瘤片由薏苡仁、拳參、北敗醬草、夏枯草等成分組成，方中薏苡仁、拳參健脾益氣，北敗醬草、夏枯草解毒散結(jié)。臨床實(shí)踐證實(shí)，該藥對(duì)于脾虛痰結(jié)證的乳腺良惡性腫塊性疾病具有一定的臨床療效。MCF－7 細(xì)胞系是雌激素依賴性的人乳腺癌細(xì)胞系，其ER、PR 表達(dá)均為陽(yáng)性，是研究乳腺癌疾病的常見(jiàn)模型。由于目前沒(méi)有很好的乳腺增生的細(xì)胞模型，而乳腺增生癥與乳腺癌的發(fā)生關(guān)系密切［1］，乳腺增生癥的最大危害就是癌變，因此本研究借用了MCF－7 細(xì)胞系和含藥動(dòng)物血清作為研究對(duì)象，探討了軟堅(jiān)消瘤片作用細(xì)胞后的分子生物學(xué)改變。

乳腺是雌激素作用的靶器官之一。雌激素在乳腺癌發(fā)生過(guò)程中起重要作用，大約60%絕經(jīng)前和70%絕經(jīng)后乳腺癌患者是雌激素依賴性腫瘤［2］。雌激素局部水平的增高與合成增多有關(guān)，其中最重要的是合成酶的高表達(dá)，其抑制劑已經(jīng)成為乳腺癌內(nèi)分泌治療的重要手段。ER、PR 陽(yáng)性強(qiáng)度、數(shù)量隨著乳腺增生程度加重而增加［3］，ER 在正常乳腺組織、單純性增生、不典型增生和早期癌中的表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率依次為11.5%、22.0%、64.4%和67.4%，ER 在不典型增生中呈現(xiàn)高表達(dá)，提示ER 高表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)［4］。因此，調(diào)控雌激素合成及功能發(fā)揮成為藥物干預(yù)的重要靶點(diǎn)。軟堅(jiān)消瘤片藥物血清作用于MCF－7 細(xì)胞之后，能有效的降低雌激素主要合成酶芳香化酶的表達(dá)水平，該作用與目前芳香化酶抑制劑［5］起到異曲同工之效。雌激素與雌激素受體的結(jié)合啟動(dòng)雌激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，如他莫昔芬在乳腺癌的治療中起到重要作用［6］。本研究經(jīng)藥物血清作用24 h 后的細(xì)胞，雌激素受體α 表達(dá)水平下降非常明顯。內(nèi)分泌治療，如芳香化酶抑制劑能有效的延長(zhǎng)乳腺癌患者的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移并延長(zhǎng)生存期，但是其弊端也很明顯，如芳香化酶抑制劑價(jià)格較貴，并有增加患者骨質(zhì)疏松、甚至骨折的發(fā)病率，升高血脂以及雄激素過(guò)量引起的相應(yīng)不適癥狀［7］。枸櫞酸他莫西芬增加子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險(xiǎn)、治療過(guò)程中易出現(xiàn)TAM 抵抗［8］，是這些藥物的臨床應(yīng)用受到一定限制。軟堅(jiān)消瘤片作為中藥組方，在抑制芳香化酶和雌激素受體α 基因表達(dá)水平的同時(shí)，可以有效的解決上述弊端，但是其在實(shí)際臨床應(yīng)用中的療效比較和量化需要在以后的研究中證實(shí)。

雌激素受體beta 是另外一種雌激素受體，ERα 和ERβ 同屬雌激素受體家族成員［9］。其作用機(jī)制仍存在爭(zhēng)議，但普遍的認(rèn)為該基因在癌變的乳腺組織中表達(dá)水平明顯降低，屬于抑癌基因的范疇［10－11］。本研究中藥物血清作用后，ER α 基因的表達(dá)水平下降了10多倍，而beta 基因表達(dá)水平基本沒(méi)有變化。因此認(rèn)為軟堅(jiān)消瘤片在抑制ER α 基因表達(dá)的同時(shí)對(duì)beta 基因的抑癌效果沒(méi)有削弱。

細(xì)胞增殖與凋亡的失調(diào)對(duì)于疾病的發(fā)生起到重要的作用。藥物血清作用于MCF－7 細(xì)胞后，干擾了細(xì)胞的增殖周期，使細(xì)胞增殖過(guò)程在G0/G1期停滯，DNA復(fù)制和分裂活動(dòng)減弱，而靜止期及合成前期狀態(tài)的細(xì)胞增多，藥物抑制了細(xì)胞周期的正常進(jìn)行，從而使其乳腺癌細(xì)胞增殖受到阻礙。因此，軟堅(jiān)消瘤片具有降低乳腺癌細(xì)胞增殖比率、抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。之后進(jìn)行的細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)在細(xì)胞培養(yǎng)0～48 h 期間，藥物血清組生長(zhǎng)曲線差異較小;而在細(xì)胞培養(yǎng)48 h 以后，治療組的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線幅度開(kāi)始明顯低于對(duì)照組，在96 h 時(shí)抑制效果最明顯，至細(xì)胞培養(yǎng)120 h 以后，治療組的細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用開(kāi)始減弱。說(shuō)明軟堅(jiān)消瘤片在乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)的一定時(shí)段內(nèi)，表現(xiàn)出了明顯抑制乳腺癌細(xì)胞株的細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。

本研究涉及到諸多指標(biāo)，綜合指向都說(shuō)明軟堅(jiān)消瘤片在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。以往的治療藥物往往為單一靶向治療，如芳香化酶和硫酸酯酶抑制劑等［5，8］可以針對(duì)性的抑制芳香化酶和封閉ER的活性，從而降低局部乳腺組織雌激素的合成及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，本研究發(fā)現(xiàn)軟堅(jiān)消瘤片藥物血清抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用靶點(diǎn)不是單一途徑的，而是多途徑綜合協(xié)調(diào)發(fā)揮作用，包括:軟堅(jiān)消瘤片能較好地抑制乳腺癌細(xì)胞株MCF－7的CYP19mRNA、ERmRNA 表達(dá)水平;抑制乳腺癌細(xì)胞株的一定時(shí)段的細(xì)胞生長(zhǎng);抑制細(xì)胞周期的正常進(jìn)行;促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，軟堅(jiān)消瘤片藥物血清與目前的內(nèi)分泌藥物相比，在細(xì)胞學(xué)上能有效的多途徑綜合性調(diào)控MCF－7 細(xì)胞的生長(zhǎng)及內(nèi)分泌通路，這為未來(lái)乳腺良惡性患者的內(nèi)分泌治療藥物研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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