朱 滔， 梁旭方， 彭敏燕， 于海靜， 皮達峰

(暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)系，廣東 廣州 510632)

翹嘴鱖(Siniperca chuatsi)隸屬于鱸形目鱸亞目，俗稱桂魚、桂花魚、胖鱖、季花魚等，是淡水底棲的典型肉食性魚類.由于它具有體型大，生長快，味道鮮美等特點，深受國內(nèi)外消費者喜愛，有“淡水石斑魚”之稱，目前翹嘴鱖養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，已經(jīng)成為我國重要的名貴經(jīng)濟魚類，具有很大商業(yè)養(yǎng)殖價值［1］.近年來，魚類疾病不斷暴發(fā)，翹嘴鱖水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)遭受嚴重的損失.此外，過度捕撈、干旱，尤其是水替污染導(dǎo)致翹嘴鱖野生種群數(shù)量明顯下降.生產(chǎn)中近親繁殖導(dǎo)致種質(zhì)退化，已影響到翹嘴鱖養(yǎng)殖業(yè)的正常發(fā)展［2-3］.因此，完善遺傳標記體系對翹嘴鱖的遺傳多樣性，種質(zhì)資源的保護以及翹嘴鱖水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展具有重要意義.

表達序列標簽(expressed sequence tag，EST)中存在一定數(shù)量的微衛(wèi)星或簡單重復(fù)序列(ESTSSR)，它不僅具有在基因組中均勻分布、共顯性和實驗重復(fù)性好等優(yōu)點，而且開發(fā)成本較低，已成功應(yīng)用于群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、QTL定位和分子標記輔助選擇育種等研究領(lǐng)域［4-7］.目前，用于翹嘴鱖遺傳多樣性研究的分子標記主要是微衛(wèi)星和單核苷酸多態(tài)性 (single nucleotide polymorphism，SNP)標記.Yang等［8］、Qu 等［9］開發(fā) EST-SSR 引物用于鱖魚的遺傳多樣性研究;楊宇輝等［10］利用SNP標記翹嘴鱖的脂蛋白酯酶和胃蛋白酶并進行食性馴化分析.但是，用于群體遺傳結(jié)構(gòu)研究的高效微衛(wèi)星標記開發(fā)目前還在初步階段，供選擇使用的微衛(wèi)星標記較少，在研究野外翹嘴鱖群體結(jié)構(gòu)方面則更少.因此，本研究擬從翹嘴鱖EST數(shù)據(jù)庫中開發(fā)微衛(wèi)星序列，篩選更多具有多態(tài)性的可供翹嘴鱖研究使用的微衛(wèi)星引物，并應(yīng)用于陸水水庫和懷化的翹嘴鱖群體遺傳結(jié)構(gòu)的研究.以期為野生翹嘴鱖種質(zhì)資源的保護，遺傳育種和人工養(yǎng)殖群體的擴充等方面研究提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗群體和基因組DNA的提取

試驗魚取自赤壁(湖北省)和沅江流域(湖南省)的野生翹嘴鱖群體，赤壁翹嘴鱖群體27尾，沅江流域(常德16尾;懷化18尾)翹嘴鱖群體共34尾.采樣后取鰭條保存在體積分數(shù)95%的酒精之中，然后按照TIANGEN DNA提取試劑盒推薦方法提取基因組DNA.

1.2 微衛(wèi)星分子標記開發(fā)及引物設(shè)計

利用本實驗室自行開發(fā)的鱖魚EST序列，從中選取重復(fù)單元為二核苷酸至六核苷酸，重復(fù)次數(shù)不少于5次的微衛(wèi)星位點共120個，篩去不能設(shè)計引物的序列，使用NCBI/Primer-BLAST為剩余的91個的微衛(wèi)星序列設(shè)計PCR擴增引物，相關(guān)的參數(shù)均設(shè)為默認值(引物長度18～27 bp，最適長度為20 bp;擴增退火溫度57～63℃，最適溫度為60℃;鳥嘌呤(G)胞嘧啶(C)含量 20% ～80%，最適含量為50%;擴增產(chǎn)物長度100～1 000 bp，最適長度為200 bp).所有引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成.

1.3 PCR擴增和多態(tài)性檢測

對篩選后的具有多態(tài)性的微衛(wèi)星引物進行PCR擴增.25 μL PCR反應(yīng)體系如下:10×Buffer溶液2.5 μL，每對引物0.5 μL，dNTP 0.25 μL，ddH2O20.25 μL，模版 DNA 0.5 μL 和 0.5 μL Taq 酶.PCR擴增反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，tm℃退火1 min，72℃延伸45 s，35個循環(huán)，隨后72℃延伸10 min.PCR擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得特異的PCR擴增產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染檢測，然后采用全自動凝膠成像分析系統(tǒng)(AlphalmagerTM)記錄電泳結(jié)果.

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

微衛(wèi)星引物擴增結(jié)果中每條帶表示一個等位基因，根據(jù)微衛(wèi)星擴增產(chǎn)物銀染后顯示的等位基因來統(tǒng)計兩個翹嘴鱖群體的基因型.微衛(wèi)星多態(tài)性參數(shù)由種群遺傳變異分析軟件POP2GENE(Version 1131)計算，包括等位基因頻率、每個位點的等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因(Ne)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和哈迪-溫伯格平衡，進行多態(tài)信息含量(PIC)的計算.

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性EST-SSRs標記的序列信息和電泳檢測結(jié)果

從合成的91對EST-SSRs引物中共篩選出22對能擴增穩(wěn)定、條帶清晰并且具有多態(tài)性的引物，序列信息見表1.在兩個翹嘴鱖群體中共檢測到134個等位基因，平均等位基因數(shù)為6.090 1個.微衛(wèi)星基因座SC19電泳情況見圖1.

圖1 引物SC19的擴增電泳圖Fig.1 Electrophoresis pattern of locus SC19

2.2 群體遺傳多樣性分析

經(jīng)分析得到翹嘴鱖群體的遺傳多樣性參數(shù)，結(jié)果見表2和表3.由表2可知，除了位點SC2(Ho=0.283 3)、SC3(Ho=0.203 4)和 SC15(Ho=0.169 5)以外，大部分翹嘴鱖微衛(wèi)星位點遺傳多樣性較高，其平均觀測雜合度為0.675 4，平均期望雜合度0.748 7;平均多態(tài)信息含量為0.701 0，大于0.5的多態(tài)信息含量具有高度的多態(tài)性，表明等位基因分布均勻，多態(tài)性較高，適用于進行翹嘴鱖遺傳多樣性的研究.根據(jù)Nei等［11］計算群體間的遺傳距離和遺傳相似系數(shù)，結(jié)果表明，翹嘴鱖的22個微衛(wèi)星位點的Fst值為0.011 7 ～0.160 6，平均 Fst值是 0.038 3(Fst＜0.05)，說明翹嘴鱖群體間的分化程度較小.

由表3可知，赤壁群體的等位基因數(shù)最多(6.000 0)，常德(5.409 1)與懷化(5.454 5)群體的等位基因數(shù)相當;平均觀測雜合度為0.656 6～0.658 9，平均期望雜合0.710 0 ～0.744 6;多態(tài)信息含量均高于0.5，表明3個群體具有高度的遺傳多樣性.

表2 22個EST-SSRs位點的遺傳多樣性參數(shù)Table2 Genetic diversity parameters of 22 EST-SSRs markers

表3 3個翹嘴鱖群體的遺傳多樣性參數(shù)Table3 Genetic diversity parameters of 3 Siniperca chuatsi populations

2.3 群體間的遺傳相似度和遺傳距離

遺傳相似性指數(shù)和遺傳距離是衡量群體親緣關(guān)系的重要的指標.一級親緣關(guān)系的個體間遺傳相似指數(shù)為0.5，二級親緣關(guān)系為0.25［11］.根據(jù) Nei指數(shù)法計算三個翹嘴鱖群體之間的遺傳相似性指數(shù)和遺傳距離見表4.由表中可知，3個群體的遺傳相似度均大于0.5，說明它們之間的親緣關(guān)系較近.其中，常德和懷化兩個群體間的遺傳相似度最大(0.884 2)，遺傳距離最短(0.123 1)，這兩個群體親緣關(guān)系最近;而常德與赤壁的遺傳相似度最小(0.844 0)，遺傳距離最大(0.169 6).

表4 3個翹嘴鱖群體間的遺傳相似度和遺傳距離Table4 Genetic idenity and genetic distance of 3 Siniperca chuatsi population

3 討論

EST-SSR序列大多數(shù)與已知和未知的功能基因連鎖，在生物進化中起到編碼氨基酸和蛋白質(zhì)的重要作用，比基因組所受到的選擇壓力大，其變異頻率偏低、變異類型也會偏少［12］.本研究所用的 ESTSSRs引物中雙堿基所占的比例較大，重復(fù)序列以(AC)n/(GT)n為主(占70.4%)，該結(jié)論與許多學(xué)者的研究一致.宋春妮等［13］研究發(fā)現(xiàn)(AC)n/(GT)n類型微衛(wèi)星序列在日本蟳中含量非常豐富.李偲等［14］在草魚EST-SSRs標記中開發(fā)的(AC)n/(GT)n重復(fù)位點也最多，占二核苷酸重復(fù)位點總數(shù)的50.3%.Wang和魯翠云等［15-16］在鯉魚 ESTs中篩選出EST-SSRs，(AC)n/(GT)n占雙堿基重復(fù)類型的67.57%.

等位基因數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度和多態(tài)信息含量等都是反映群體遺傳基礎(chǔ)多樣性水平的指標，是基因豐富度的體現(xiàn)，其數(shù)值越大，說明基因豐富度越高，遺傳潛力越大［17］.多態(tài)信息含量(PIC)起衡量基因片段多態(tài)性的作用，當 PIC＞0.5時，該座位為高度多態(tài)性座位;0.25＜PIC＜0.5時，為中度多態(tài)性座位;PIC＜0.25時，為低度多態(tài)性座位［18］.本實驗中22個微衛(wèi)星位點的遺傳多樣性較為豐富，其觀測雜合度和期望雜合度分別是0.675 4和0.748 7.所有位點中除了位點SC2、SC3和SC15的PIC值較低，屬于中度多態(tài)性座位，其余的位點均為高度多態(tài)性座位，平均多態(tài)信息含量為0.701 0，表明其等位基因分布較均勻，多態(tài)性較高，適合用于進行翹嘴鱖群體的遺傳多樣性研究.對3個翹嘴鱖群體的遺傳參數(shù)進行統(tǒng)計，各群體的雜合度較高，PIC值也顯示了高度多態(tài)性.

遺傳分化指數(shù)(Fst)是反映亞群間遺傳分化的重要指標.本研究中群體平均Fst值為0.038 3，揭示了翹嘴鱖群體遺傳分化程度較低.根據(jù)Nei's指數(shù)法得到翹嘴鱖群體間的遺傳相似性指數(shù)和遺傳距離，常德和懷化兩個群體間的遺傳相似度最大，遺傳距離最短;而赤壁與常德和懷化兩個群體的遺傳相似度較小，遺傳距離較大，數(shù)值相當.說明了常德和懷化群體的親緣關(guān)系較近，而與赤壁的親緣關(guān)系較遠.這與常德和懷化群體來自湖南省的沅江流域，而赤壁群體來自湖北省的赤壁有關(guān).王解芳等［19］根據(jù)5個草魚群體的遺傳距離構(gòu)建了UPGMA樹，結(jié)果長江水系的長沙群體、石首群體與監(jiān)利群體聚成一支;珠江水系的肇慶群體與清遠群體聚成一支，這也恰好證明了遺傳距離與其地理分布情況基本一致.此外，運用F-檢測分析群體間的親緣關(guān)系可避免生產(chǎn)養(yǎng)殖中近親繁殖導(dǎo)致的種質(zhì)退化.

本研究從翹嘴鱖的EST文庫中開發(fā)并篩選出具有多態(tài)性的微衛(wèi)星標記共22個，絕大多數(shù)位點在3個翹嘴鱖群體中表現(xiàn)出了較高的遺傳多樣性，并適用于進行群體間的親緣關(guān)系分析.這為以后翹嘴鱖的遺傳育種和人工養(yǎng)殖群體的擴增提供了理論依據(jù)，且對翹嘴鱖野生種質(zhì)資源的保護具有重要的意義.

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