余君彤， 楊蕎嘉， 鄢思斯， 馬三梅， 王永飛

(暨南大學(xué)生物工程學(xué)系，廣東 廣州 510632)

氣孔是植物體與外界環(huán)境進行氣體交換的通道，它通常由2個保衛(wèi)細胞圍繞而成.保衛(wèi)細胞對外部環(huán)境非常敏感，強光、高溫、干旱和一定量的外源水楊酸、脫落酸、乙烯、H2O2、赤霉素和NO等物質(zhì)均能誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉.植物體的光合作用、呼吸作用、水分代謝以及免疫反應(yīng)［1］等都與氣孔運動密切相關(guān).前人關(guān)于氣孔運動的研究主要集中在植物的葉片，但目前已經(jīng)在植物的非光合器官如花冠［2-3］、果實［4-5］、種子［6］、初生根［7］、蜜腺［8-9］等部位的表皮發(fā)現(xiàn)有氣孔存在.這些發(fā)現(xiàn)拓寬了氣孔的分布范圍，為研究氣孔運動提供新材料.

蔥蓮(Zephyranthes candida)別名蔥蘭、玉簾、白花菖蒲，石蒜科(Amaryllidaceae)蔥蓮屬(Zephyranthes Herb)的多年生草本植物.地下具鱗莖，線形葉，花單生于花莖頂端，蒴果近球形，3瓣開裂，種子黑色，扁平.我們前期的研究表明蔥蓮果皮上有氣孔分布［10］.雖然前人已經(jīng)對果皮上氣孔分布進行大量研究，但關(guān)于果實上氣孔運動的研究尚未見報道.這些氣孔的開關(guān)機制如何，NO和水楊酸能否影響這些氣孔的開關(guān)，對這些問題，目前還沒有明確的答案.

本試驗用不同濃度的NO供體硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)和水楊酸(salicylic acid，SA)分別對蔥蓮?fù)夤みM行處理，觀察氣孔孔徑的變化，以探討NO和SA對蔥蓮?fù)夤饪钻P(guān)閉的單獨影響，并結(jié)合NO清除劑血紅蛋白(hemoglobin，Hb)和硝酸還原酶(nitrate reductase，NR)抑制劑疊氮化鈉(sodium azide，NaN3)對NO和SA的相互關(guān)系進行分析，為深入了解蔥蓮果實上氣孔的功能以及在調(diào)控蔥蓮果實氣孔運動過程中NO與SA的相互關(guān)系和作用機制奠定基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 植物材料

實驗材料是暨南大學(xué)校園內(nèi)人工栽培的蔥蓮(Zephyranthes candida(Lindl.)Herb).采集直徑為1.4 cm左右的果實，對其外果皮進行研究.

1.2 NO和SA處理

將蔥蓮的果實先用蒸餾水洗凈，撕取外果皮，用毛筆小心刷除黏附的葉肉細胞，放入盛有表皮條緩沖液(10 mmol·L-1Mes/KOH，50 mmol·L-1KCl，100 μmol·L-1CaCl2，pH 6.20)的培養(yǎng)皿中，置于25 ℃和可見光(PAR 300 μmol·m-2·s-1)下處理3 h以促使氣孔處于開放狀態(tài).每個實驗處理觀察10個表皮條，重復(fù)3次.

(1)單獨處理 研究單獨的NO和SA對光下氣孔運動的影響時，將光下處理3 h的表皮條轉(zhuǎn)移到含有不同濃度 NO(1、10、100 和1000 μmol·L-1)或 SA(1、10、100 和 1 000 μmol·L-1)的 MES 緩沖液內(nèi)，繼續(xù)處理3 h，測量氣孔孔徑.

(2)共處理 研究NO和SA對光下氣孔運動的相互關(guān)系時，將可見光下處理3 h的表皮條分別轉(zhuǎn)移到以下3種含有不同物質(zhì)的MES緩沖液內(nèi):(Ⅰ)100 μmol·L-1NO;(Ⅱ)100 μmol·L-1SA;(Ⅲ)100 μmol·L-1NO 和 100 μmol·L-1SA.在 25℃可見光下培養(yǎng)3 h后，測量表皮條氣孔孔徑并拍照記錄.

研究清除NO后，SA對蔥蓮?fù)夤饪走\動的影響時，將可見光下處理3 h的表皮條分別轉(zhuǎn)移到以下含有不同物質(zhì)的MES緩沖液內(nèi):

(Ⅰ)質(zhì)量分數(shù)1%Hb;

(Ⅱ)100 μmol·L-1NaN3;

(Ⅲ)100 μmol·L-1SA;

(Ⅳ)質(zhì)量分數(shù)1%Hb和100 μmol·L-1SA;

(Ⅴ)100 μmol·L-1NaN3和 100 μmol·L-1SA.

在25℃可見光下培養(yǎng)3 h后，測量表皮條氣孔孔徑并拍照記錄.

1.3 氣孔孔徑的測定

用Nikon YS100顯微鏡，在40倍物鏡下，每個處理測量80個氣孔的孔徑，取平均值.

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)處理和相關(guān)分析用SPSS 13.0和Excel 2003軟件完成.

2 結(jié)果

2.1 NO對蔥蓮?fù)夤ど蠚饪钻P(guān)閉的影響

在1 ～1 000 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，NO 可顯著誘導(dǎo)蔥蓮?fù)夤さ臍饪钻P(guān)閉(P＜0.05)，且具有明顯的濃度效應(yīng)，隨著NO濃度的升高，其誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉的作用更加明顯(圖1).加入NO 3 h后，NO濃度為 1、10、100 和 1 000 μmol·L-1的蔥蓮的花冠下表皮氣孔孔徑分別比 0 μmol·L-1時減小 18.7%、23.2%、28.8%和 34.4%.

圖1 不同濃度NO對蔥蓮?fù)夤ど蠚饪钻P(guān)閉的影響Fig.1 Effect of NO on the stomatal closure on the epicarp of Z.candida with different concentrations

2.2 SA對蔥蓮?fù)夤ど蠚饪钻P(guān)閉的影響

圖 2 顯示，在1 ～1 000 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，SA可顯著誘導(dǎo)蔥蓮?fù)夤さ臍饪钻P(guān)閉(P＜0.05)，且也具有明顯的濃度效應(yīng)，SA濃度越高，氣孔孔徑越小，誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉的作用越明顯.加入SA 3 h后，SA 濃度為 1、10、100 和 1 000 μmol·L-1的蔥蓮?fù)夤饪卓讖椒謩e比0 μmol·L-1時減小19.1%、23.3%、30.6%和 42.7%.

圖2 不同濃度SA對蔥蓮?fù)夤ど蠚饪钻P(guān)閉的影響Fig.2 Effect of SA on the stomatal closure on the epicarp of Z.candida with different concentrations

2.3 NO和SA在誘導(dǎo)蔥蓮?fù)夤ど蠚饪钻P(guān)閉中的關(guān)系

如圖3 所示，處理3 h 后，100 μmol·L-1NO 和100 μmol·L-1SA均顯著促進氣孔關(guān)閉(P＜0.05)，用這兩者共同處理蔥蓮?fù)夤r，其誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉的效應(yīng)進一步增強(P＜0.05).單獨的100 μmol·L-1NO和SA處理下的氣孔孔徑分別比對照減小29.7%和31.1%，兩者共處理時，氣孔孔徑比對照減小53.4%.

圖3 NO和SA在誘導(dǎo)蔥蓮?fù)夤ど蠚饪钻P(guān)閉中的關(guān)系Fig.3 Relation of NO and SA on the stomatal closure on the epicarp of Z.candida

2.4 清除NO對SA誘導(dǎo)蔥蓮?fù)夤ど蠚饪钻P(guān)閉作用的影響

圖4顯示，NO的清除劑Hb本身可使氣孔孔徑比對照略微減小(P＞0.05)，當(dāng) SA和 Hb共處理時，氣孔孔徑比單獨的SA處理時顯著增大(P＜0.05);同樣NR的抑制劑NaN3本身也可使氣孔孔徑略微減小(P＞0.05)，在 SA處理的同時加入NaN3也可降低SA誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉的效應(yīng).

圖4 Hb和NaN3對SA誘導(dǎo)蔥蓮?fù)夤ど蠚饪钻P(guān)閉的影響Fig.4 Effect of Hb and NaN3on SA-induced stomatal closure on the epicarp of Z.candida

3 討論

NO和SA是廣泛存在于植物體內(nèi)的生長調(diào)節(jié)物質(zhì).NO是一種具有水溶性和脂溶性的氣體小分子，作為植物體內(nèi)重要的信號分子，能夠調(diào)節(jié)植物體的氣孔運動、種子萌發(fā)、生長發(fā)育、防御反應(yīng)、基因表達和細胞凋亡等生理過程［11-13］.NO常溫下不穩(wěn)定，通常用SNP作為NO的外源供體［12］.在植物細胞中主要通過兩種途徑合成NO，硝酸還原酶(nitrate reductase，NR)途徑和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)途徑［14］.外源 NO 可以誘導(dǎo)蠶豆、豌豆、紫色鴨跖草、擬南芥、番茄、大麥和小麥的氣孔關(guān)閉，并且具有濃度效應(yīng)和時間效應(yīng).SA是植物體內(nèi)普遍存在的一種酚類化合物，在植物體內(nèi)有多種生理調(diào)節(jié)作用，如促進乙烯的生物合成，調(diào)節(jié)植物的光周期，影響黃瓜的性別分化，影響植物的抗病性，誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉等.Chen等［15］的研究表明SA的作用機制可能部分與H2O2有關(guān).王曉黎等［16］發(fā)現(xiàn)黃瓜子葉表皮氣孔開度對SA的響應(yīng)表現(xiàn)出濃度效應(yīng)和時間效應(yīng).NO和SA對蔥蓮果實上氣孔運動的影響經(jīng)過本實驗進一步表明，1～1 000 μmol·L-1NO和SA均能促進蔥蓮果實上的氣孔關(guān)閉(圖1，2).

NO和SA在植物體內(nèi)的一些生理反應(yīng)上存在相互關(guān)系.NO和SA都能增強植物體的防御反應(yīng)［17］.NO可通過復(fù)雜的信號傳導(dǎo)激活苯丙氨酸解氨酶合成SA［18］;SA能通過改變順烏頭酸酶、過氧化物酶和過氧化氫酶來參與NO的生理效應(yīng)［17］.本實驗結(jié)果表明，NO和SA共同處理蔥蓮?fù)夤r，其誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉的效應(yīng)明顯大于NO或SA的單獨處理(P＜0.05).NO和SA在誘導(dǎo)蔥蓮果實上氣孔關(guān)閉過程中，具有協(xié)同效應(yīng)，NO和SA的信號交叉也可能存在于蔥蓮果實(圖3).

為了進一步了解NO和SA在調(diào)控氣孔運動過程中的相互關(guān)系，我們又測定了NO的清除劑和NR抑制劑對SA調(diào)控蔥蓮?fù)夤ど蠚饪走\動的影響.結(jié)果表明，NO的清除劑和NR抑制劑可明顯降低SA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉效應(yīng)(圖4).NO參與了SA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉，并且SA可能是通過激活植物體內(nèi)的NR途徑產(chǎn)生NO.而NO和SA在蔥蓮果實內(nèi)誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉的確切機制還有待進一步研究.

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