譚雪芳 陳玲珍

（廣州市第十二人民醫(yī)院，廣東 廣州 510000）

CIK細(xì)胞的生物學(xué)特性及在腫瘤治療中的應(yīng)用

譚雪芳 陳玲珍

（廣州市第十二人民醫(yī)院，廣東 廣州 510000）

細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine induced killer cell，CIK)是一種新型的免疫活性細(xì)胞，它是將人外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外經(jīng)過多種細(xì)胞因子（IFN-γ、rIL-2和anti-CD3mAb）共同誘導(dǎo)培養(yǎng)一段時(shí)間后產(chǎn)生的。經(jīng)過特定的細(xì)胞因子，在特定時(shí)間誘導(dǎo)處理后，既表達(dá)NK細(xì)胞標(biāo)記（CD56+），又表達(dá)T細(xì)胞標(biāo)記（CD3+和TCR-α/β+）的高效細(xì)胞毒性細(xì)胞，兩者對于CIK的細(xì)胞毒作用都有貢獻(xiàn)，使得它們具有高效抗腫瘤作用；增殖速度快，CIK細(xì)胞的數(shù)量可增加1000倍，細(xì)胞毒的活性也大大增加。殺瘤活性高、殺瘤譜廣及非MHC限制性殺瘤的優(yōu)點(diǎn)，在基礎(chǔ)及臨床研究中探討也在不斷深入，以探索更有效的腫瘤生物治療方法，為臨床治療提供依據(jù)。

CIK細(xì)胞；生物特性；腫瘤治療

惡性腫瘤是危害人類健康的重要疾病之一。但普遍的治療手段主要是手術(shù)、放療、化療為主。卻始終無法解決徹底清除殘存癌細(xì)胞的問題，癌癥的復(fù)發(fā)率和病死率仍然相當(dāng)高。生物治療已成為繼放化療后腫瘤治療的又一治療模式。研究發(fā)現(xiàn)CIK細(xì)胞對胃癌、肺癌、腸癌、肝癌、淋巴瘤（T細(xì)胞淋巴瘤除外）、白血病、多發(fā)性骨髓瘤等自體干細(xì)胞移植或放化療后微小殘留病變患者以及局限性腫瘤的介入治療（腫瘤負(fù)荷過重效果不好）等多種腫瘤有明顯的殺傷效果。

1 CIK細(xì)胞的生物學(xué)特性

1.1 CIK細(xì)胞特性

①CIK細(xì)胞具有更強(qiáng)的抗腫瘤細(xì)胞毒作用；而且，更為重要的是，與CTL不同，CIK細(xì)胞的作用無MHC限制；②CIK細(xì)胞有更強(qiáng)的增殖力，滿足體內(nèi)有效免疫治療需要大量效應(yīng)細(xì)胞的要求；③CIK細(xì)胞的高增殖力和高細(xì)胞毒作用可以降低治療中IL-2的劑量，因而用CIK細(xì)胞替代LAK細(xì)胞用于免疫治療，可以降低高劑量IL-2引起的毒副作用，如造成血小板減少，致死性的毛細(xì)血管滲漏綜合癥等，解決了過繼免疫治療中的這一重要問題；④CIK細(xì)胞雖然對淋巴瘤細(xì)胞具有很高的細(xì)胞毒作用，但對鼠骨髓干細(xì)胞的毒性很低，對正常人造血祖細(xì)胞CFU-GM幾乎沒有毒性，而LAK細(xì)胞則被認(rèn)為是潛在的骨髓前體細(xì)胞的抑制劑。

1.2 CIK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的機(jī)制?

首先生物治療的理論依據(jù)：機(jī)體內(nèi)既存在著基因突變、發(fā)生腫瘤的可能性，同時(shí)又存在著消除基因突變、腫瘤發(fā)生的機(jī)制和免疫能力，腫瘤的發(fā)生發(fā)展和播散是由于腫瘤與機(jī)體防御之間的動態(tài)平衡破壞的結(jié)果，生物學(xué)治療就是著眼于提高腫瘤患者的抗腫瘤免疫能力和從基因水平調(diào)控細(xì)胞的基因表達(dá)過程起到治療、控制腫瘤的效果和目的。因此：①細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（CIK）是一類共同表達(dá)CD3和CD56的高效細(xì)胞毒性細(xì)胞，是外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)過多種細(xì)胞因子（IFN-γ、rIL-2和anti-CD3mAb）共同誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生的。只有經(jīng)過特定的細(xì)胞因子，在特定時(shí)間誘導(dǎo)處理后，CD3+/CD56+表型的細(xì)胞（CIK細(xì)胞）的數(shù)量可增加1000倍，細(xì)胞毒的活性也大大增加。實(shí)驗(yàn)研究表明，在培養(yǎng)中產(chǎn)生的大多數(shù)CD3+/CD56+CIK細(xì)胞主要來源于CD3+/CD56-的T細(xì)胞，而不是原先少量存在的CD3+/CD56+細(xì)胞優(yōu)勢生長的結(jié)果，也不是來自CD3-/CD56+的NK細(xì)胞。②還有一部分CD3+/CD56+細(xì)胞來源于CD4+和CD8+細(xì)胞。這是由于anti-CD3單抗對CD3+T細(xì)胞的增殖刺激作用，導(dǎo)致了CD56+細(xì)胞群通過細(xì)胞與細(xì)胞接觸或分泌某種細(xì)胞因子而得以共表達(dá)和擴(kuò)增，增強(qiáng)了抗腫瘤活性作用。③另外CIK細(xì)胞的主要效應(yīng)細(xì)胞上既表達(dá)NK細(xì)胞標(biāo)記（CD56+），又表達(dá)T細(xì)胞標(biāo)記（CD3+和TCR-α/β+），二者對于CIK的細(xì)胞毒作用都有貢獻(xiàn)，使得它們具有高效抗腫瘤作用。

1.3 CIK細(xì)胞的制備

①材料準(zhǔn)備。試劑：PBS，生理鹽水、3%冰醋酸，AIM-V培養(yǎng)基或RPMI-1640，自體血漿，白細(xì)胞介素-2（IL-2），干擾素-gamma（interferon gamma，IFN-γ），抗人CD3單克隆抗體；材料：10mL移液管，50m離心管、電動移液器，槍頭移液器，EP管，培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿或培養(yǎng)袋；儀器：計(jì)數(shù)板（器）、倒置顯微鏡，水平離心機(jī)等。②制備方法：用Ficoll-Hypaque淋巴細(xì)胞分離液，使用密度梯度離心方法，常規(guī)分離患者的外周血，以3%冰醋酸以溶解可能存在的紅細(xì)胞，提取單個(gè)核細(xì)胞懸液，倒置顯微鏡下計(jì)細(xì)胞總數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL進(jìn)行培養(yǎng)，于培養(yǎng)體系中加入自體血漿，多種細(xì)胞因子-IFN-γ干擾素、重組人白細(xì)胞介素-2（rhIL-2）、抗CD3單克隆抗體等進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)擴(kuò)增制得。這樣制備出來的CIK細(xì)胞在培養(yǎng)21d，提取的單核細(xì)胞數(shù)從1×107可增長到1×1010-11。在三周的觀察期內(nèi)，細(xì)胞增殖高峰時(shí)間在第7d～21d，細(xì)胞數(shù)可增長1000倍以上。圖1和圖2為CIK不同生長天數(shù)在激光顯微鏡下拍攝的照片。

圖1 CIK細(xì)胞培養(yǎng)72h的圖片

圖2 CIK細(xì)胞培養(yǎng)第10天的照片

1.4 CIK細(xì)胞的增殖力

大部分實(shí)驗(yàn)中通過干擾IFN-γ、IL-2和抗CD3McAb等細(xì)胞因子誘導(dǎo)外周血或臍血中的CIK細(xì)胞，經(jīng)14～21d擴(kuò)增的CIK細(xì)胞其比例可由0.10%～0.13%，上升至19.0%～20.5%，CIK細(xì)胞的高增殖活性解決了體外擴(kuò)增效應(yīng)細(xì)胞所獲細(xì)胞數(shù)目少的難題。

1.5 CIK細(xì)胞表型分析

CIK細(xì)胞在肝臟中分布最多，其次為外周血。通過表面標(biāo)志分析，CIK細(xì)胞為CD3、CD56雙陽性細(xì)胞群，但主要來源于CD3+CD56-的T淋巴細(xì)胞，而非原先少量存在的CD3+/CD56+細(xì)胞優(yōu)勢生長的結(jié)果，也不是CD3-CD56+的NK 細(xì)胞。CIK細(xì)胞的另一重要來源是CD4-CD8+的T淋巴細(xì)胞群。此外，CD4-CD8-的T細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)后，其中56%可同時(shí)表達(dá)CD3+CD56+，故CIK細(xì)胞也可來源于CD4-、CD8-的T細(xì)胞。不表達(dá)CD14、CD45。

2 CIK細(xì)胞的不同來源

常用的CIK細(xì)胞主要來患者自體或者異體正常供者，而CIK細(xì)胞應(yīng)用于臨床，就要保證避免意外感染的機(jī)會，許多學(xué)者在研究尋找更有效的前體細(xì)胞。

2.1 自體CIK細(xì)胞

用患者自身的CIK細(xì)胞，經(jīng)體外擴(kuò)增回輸，可避免由于交叉感染引發(fā)的其他疾病，安全性得到了極大提高。我科已將自體CIK細(xì)胞回輸給腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、腸癌、淋巴瘤（T細(xì)胞淋巴瘤除外）、白血病、多發(fā)性骨髓瘤等自體干細(xì)胞移植或放化療后微小殘留病變患者，以及局限性腫瘤的介入治療原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者體內(nèi)后，BCL-ABL轉(zhuǎn)陰，且提高了患者機(jī)體的免疫應(yīng)答水平，改善了肝臟功能，患者的癥狀減輕，無不良反應(yīng)。臨床治療觀察顯示，用C1K細(xì)胞聯(lián)合化療治療晚期肺癌、肝癌、淋巴瘤、白血病放化療后微小殘留病變患者，能明顯提高患者的生存質(zhì)量，延長晚期胃癌患者的兩年生存期，同時(shí)副作用小、只有少數(shù)患者有低燒癥狀。

2.2 臍血CIK細(xì)胞

經(jīng)傳染病血常規(guī)生化等各項(xiàng)檢查正常的產(chǎn)婦，在嚴(yán)格無菌的條件下采集，臍血采集方便，來源又廣泛，輸注臍血CIK細(xì)胞不易引起嚴(yán)重移植物排斥反應(yīng)，對其研究不斷深入，臍血CIK細(xì)胞分離提取的單核細(xì)胞多體外擴(kuò)增快，殺傷活性強(qiáng)，對腫瘤細(xì)胞的作用顯著優(yōu)于外周血CIK細(xì)胞，經(jīng)過大量體外實(shí)驗(yàn)已為進(jìn)一步臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，而臍血CIK細(xì)胞輸入患者后的療效還有待進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)去驗(yàn)證。

2.3 骨髓CIK細(xì)胞

骨髓來源CIK細(xì)胞增殖能力較外周血來源的CIK細(xì)胞稍差，但仍具有相當(dāng)高的增殖能力，且在細(xì)胞毒方面與外周血CIK細(xì)胞相似。但采取較困難，不易得。

3 CIK細(xì)胞在臨床上的應(yīng)用

3.1 作為傳統(tǒng)治療的輔助治療

體內(nèi)回輸免疫活性細(xì)胞的過繼免疫療法，可以在不損傷機(jī)體免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的前提下，直接殺傷腫瘤細(xì)胞。調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，在清除微小殘留病灶方面，免疫細(xì)胞也發(fā)揮著重要作用，因而成為腫瘤手術(shù)、放療、化療的重要輔助手段，為預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)，改善晚期患者的生存質(zhì)量提供了新途徑。微創(chuàng)治療后聯(lián)合CIK細(xì)胞免疫治療可提高肝癌患者的免疫功能，對降低肝癌的復(fù)發(fā)率具有重要作用。我科最近開展的經(jīng)肝動脈栓塞化療聯(lián)合局限性腫瘤的介入治療和CIK細(xì)胞治療原發(fā)性肝癌的一種新模式，它明顯降低乙型肝炎病毒含量或消除乙型肝炎病毒，阻斷致癌因素。同時(shí)CIK細(xì)胞對肺癌、胃癌、乳腺癌、腸癌、食道癌、腎癌、血液方面等多種惡性腫瘤的治療取得一定的療效。

3.2 造血干細(xì)胞移植后的免疫治療，對進(jìn)行自體造血干細(xì)胞移植的患者進(jìn)行了試驗(yàn)，我科目前開展很少。

3.3 CIK細(xì)胞與IL-2的聯(lián)合應(yīng)用

研究顯示CIK細(xì)胞/IL-2的臨床療效受腫瘤負(fù)荷制約，接受CIK/IIJ-2輔助治療前應(yīng)聯(lián)合其它療方法盡量降低腫瘤負(fù)荷，腫瘤負(fù)荷低于106細(xì)胞時(shí)免疫治療可能取得最佳效果。我科目前對10例血液淋巴瘤（T細(xì)胞淋巴瘤除外）、白血病腫瘤患者，放化療2周后接受CIK/IL-2聯(lián)合治療，隨訪6～18個(gè)月。有3例患者未發(fā)現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，顯示CIK/IL-2可延緩淋巴瘤（T細(xì)胞淋巴瘤除外）、白血病、腫瘤進(jìn)展時(shí)間，提高患者的生活質(zhì)量，無明顯毒副作用，可作為綜合治療方案的輔助治療。

4 治療輸注方法

CIK治療3～5次為1個(gè)療程，每日1次，每次細(xì)胞輸注量不低于3× 109個(gè)，每療程細(xì)胞總數(shù)≥1.5×1010個(gè)。多療程CIK治療時(shí)每2月接受一次CIK輸注或根據(jù)臨床病情而定。胸、腹水時(shí)CIK局部用量：1×109個(gè)+50mLNS于細(xì)胞收集后1h內(nèi)注入。

5 結(jié) 論

CIK細(xì)胞治療必將成為腫瘤治療中最有潛力的發(fā)展方向，如何通過CIK治療和其他治療手段結(jié)合，提高治療效果和改善生存質(zhì)量，無疑將有助于更好地發(fā)揮細(xì)胞治療的作用，推動細(xì)胞治療健康有序的發(fā)展。CIK治療最佳療效的獲取和長期療效的維持是CIK治療的核心，提高CIK細(xì)胞數(shù)量和活力是CIK療效高低的關(guān)鍵，同時(shí)CIK細(xì)胞數(shù)量和活力也與腫瘤負(fù)荷量和個(gè)體整體體能差異密切相關(guān)?？傊?，CIK細(xì)胞治療惡性腫瘤具有廣闊的前景，是未來治療惡性腫瘤的重要手段之一。

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