楊致榮，王興春，薛金愛，孟令芝，李潤植

1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西太谷 030801

2 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)文理學(xué)院，山西太谷 030801

3 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801

WRKY 是植物特有的一個轉(zhuǎn)錄因子超家族，它們都含有1個或2個獨特的WRKY DNA 結(jié)合域。WRKY 域是一段由60個左右氨基酸殘基組成的多肽，因其N 端有高度保守的WRKYGQK核心序列而得名[1]。WRKY 域的C 末端是一個典型的鋅指結(jié)構(gòu)，即C2H2(氨基酸的組成模式為C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H)或C2HC (氨基酸的組成模式為C-X7-C-X23-H-X1-C)[2]。WRKY 域能特異地與靶基因啟動子 W-box 序列[2]，或 SURE(Sugar-responsive cis-element)[3]結(jié)合，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)。根據(jù)其結(jié)構(gòu)域的數(shù)目及鋅指結(jié)構(gòu)的類型可將WRKY 轉(zhuǎn)錄因子分為3大類群：第1類含有2個WRKY 結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)類型為C2H2型；第2和第3大類群WRKY 轉(zhuǎn)錄因子只含有1個WRKY 結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)分別為C2H2和C2HC型。其中第2大類群WRKY 可進(jìn)一步分為a、b、c、d 和e 等5個亞類[1]。

自從第1個WRKY基因SPF1從白薯Ipomoea batatas 中克隆后[4]，許多物種的WRKY 基因相繼被克隆和鑒定，包括擬南芥 Arabidopsis thaliana[5-6]、水稻Oryza sativa[7]、大豆Glycine max[8-9]、松樹Pinus monticola[10]、苜蓿Medicago truncatula[11]等20多種高等植物，和綠藻Pinus monticola[12-13]及兩種非植物的真核生物腸蘭伯式鞭毛蟲 Giardia lamblia 和盤基網(wǎng)柄菌Dictyostelium discoideum[13]。長春花Cantharanthus roseus 既是一種優(yōu)良的園藝觀賞花卉，又是一種重要的藥用植物。因其植株體內(nèi)含有抗癌活性的長春堿(Vinblastine)等70多種萜類吲哚生物堿(Terpenoid indole alkaloids，TIAs)而被廣泛應(yīng)用于抗癌藥物的提取和開發(fā)，是目前研究TIAs 次生代謝的主要模式植物[14]。我們對長春花TIAs次生代謝物合成途徑的一些主要酶蛋白基因的啟動子分析發(fā)現(xiàn)，這些基因的啟動子序列含有W-box 順式元件，暗示長春花CrWRKY 轉(zhuǎn)錄因子可能參與TIAs 合成途徑的調(diào)控(楊致榮等，未發(fā)表數(shù)據(jù))。然而，有關(guān)CrWRKY 轉(zhuǎn)錄因子的種類、數(shù)量、結(jié)構(gòu)和功能還未見詳盡報道。為此，我們從長春花26009個蛋白中篩選和鑒定出47個CrWRKY 轉(zhuǎn)錄因子，并用數(shù)字基因表達(dá)譜和實時熒光定量PCR (Real time quantitative PCR，qPCR)數(shù)據(jù)對CrWRKY 轉(zhuǎn)錄因子的分類和表達(dá)譜進(jìn)行了系統(tǒng)研究，深化了對CrWRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族的成員、蛋白結(jié)構(gòu)、基因序列及其進(jìn)化的認(rèn)識。本研究為進(jìn)一步全面解析長春花WRKY的功能和萜類吲哚生物堿的合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)，有利于建立優(yōu)化的代謝工程策略以實現(xiàn)抗癌長春堿等目標(biāo)次生代謝物大規(guī)模生物合成和利用。

1 材料與方法

1.1 序列的收集與整理

擬南芥和長春花的蛋白序列分別從擬南芥生物資源中心(The Arabidopsis Information Center，ABRC，http://www.arabidopsis.org/)及藥用基因組資源數(shù)據(jù)庫(Medicinal Plant Genomics Resource，MPGR，http://medicinalplant genomics.msu.edu/)下載。首先，將下載的序列拷貝到Notepad++軟件中進(jìn)行編輯，若某一蛋白有不同序列，選擇最長的氨基酸序列；然后，將這些編輯好的蛋白序列拷貝到Excel 文件中，建成用于后續(xù)分析的蛋白序列數(shù)據(jù)庫。

1.2 長春花CrWRKY 轉(zhuǎn)錄因子的篩選和鑒定

從上述編輯好的單拷貝蛋白序列數(shù)據(jù)庫中檢索含有WRKY 的序列，并統(tǒng)計WRKYGQK 和WRKYGKK 以及這兩個基序變異序列WRKYGEK 和WRKYGSK 的數(shù)目，從而初步確定 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)目。為保證獲得的WRKY 轉(zhuǎn)錄因子信息的準(zhǔn)確性，將已鑒定含有WRKY 基序的蛋白序列在NCBI 保守域數(shù)據(jù)庫(NCBI Conserved Domain Database，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)中進(jìn)行保守域分析，進(jìn)一步鑒定具有WRKY 功能域的蛋白序列。最后，再利用 PlantTFcat (http://plantgrn.noble.org/PlantTFcat/)轉(zhuǎn)錄因子在線分析工具分析這些具有WRKY 功能域的蛋白序列，進(jìn)一步驗證其是否屬于轉(zhuǎn)錄因子。

1.3 長春花及擬南芥WRKY 序列的聚類分析及比對

參照Eulgem 等[2]定義的WRKY 結(jié)構(gòu)域，以上述鑒定的長春花及擬南芥WRKY 核心序列N端第10個氨基酸殘基開始的65個氨基酸殘基為靶標(biāo)序列，運用MEGA 5.0軟件[15]采用鄰位相連法(Neighbor-joining)進(jìn)行聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。靴值(Bootstrap)設(shè)定為3000個重復(fù)，進(jìn)化距離采用p 距離法及每個位點不同氨基酸的數(shù)目進(jìn)行計算。

運用CLUSTAL W2.1軟件[16]，將長春花CrWRKY 序列的WRKY 域分別與擬南芥相應(yīng)類群WRKY 結(jié)構(gòu)域進(jìn)行比較分析，進(jìn)而確定長春花CrWRKY 的分類。將包括有N 末端WRKY結(jié)構(gòu)域(N-terminal WRKY domains，NTWD)和C 末端 WRKY 結(jié)構(gòu)域(C-terminal WRKY domains，CTWD)的WRKY 蛋白分別標(biāo)注N 末端及C 末端結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，以鑒定N 和C 末端WRKY 結(jié)構(gòu)域的特點。

1.4 長春花CrWRKY 基序的組成分析

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的WRKY 核心序列及不同類鋅指結(jié)構(gòu)基序用MEME 4.8.0在線基序分析程序(http://meme.nbcr.net/meme/intro.html)分析其保守性。具體參數(shù)選擇如下：選擇基序位點數(shù)量最小2次以上，最大不超過50；選擇單一基序重復(fù)次數(shù)為任何；每個基序的寬度為6～100個氨基酸殘基。

1.5 CrWRKY 的表達(dá)分析

長春花基于轉(zhuǎn)錄組測序的表達(dá)數(shù)據(jù)從MPGR 數(shù)據(jù)庫下載。對47個已鑒定的WRKY 不同組織、幼苗、原生質(zhì)體(Protoplast)、毛狀根和色氨酸脫羧酶干擾(Trptophan decarboxylase interference，TDCi)及色胺鹵化酶(RebH/F)轉(zhuǎn)基因根系利用MeJA 或YE 處理的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)聚類及其表達(dá)譜分析。分析選用GenePattern(http://genepattern.broadinstitute.org/gp/pages/inde x.jsf)在線分析工具，參數(shù)設(shè)置為選用皮爾森相關(guān)系數(shù)(Pearson correlation coefficient)及類平均(Average-linkage)法，無需定心(Centering)、標(biāo)準(zhǔn)化(Normalization)及對數(shù)轉(zhuǎn)換(log transformation)處理，藍(lán)色、紅色和黑色分別表示W(wǎng)RKY 基因表達(dá)下調(diào)、上調(diào)和不受調(diào)節(jié)，顏色的深淺表示相對表達(dá)量的高低。

1.6 長春花毛狀根和原生質(zhì)體培養(yǎng)以及MeJA處理

長春花毛狀根的培養(yǎng)按照楊致榮等[17]描述的方法進(jìn)行。選用生長良好、重量相同的無性系毛狀根為樣品用100μmol/L MeJA 處理，處理方法采用Suttipanta 等的方法[18]。長春花原生質(zhì)體分離和懸浮培養(yǎng)依據(jù)Pattanaik 等[19]描述的方法進(jìn)行。毛狀根分別在處理后0、12和24 h 取樣，原生質(zhì)體分別在處理后0、6、12和24 h 取樣，隨即置于液氮中，以備后續(xù)提取RNA 之用。

1.7 總RNA 的提取和qPCR

100 mg 上述材料在液氮中研磨成粉末，用于后續(xù)RNA 提取。用DNase I 處理RNA 樣品以除去可能的DNA 殘余。cDNA 合成采用Invitrogen公司SuperScriptⅡ反轉(zhuǎn)錄體系。實時定量PCR應(yīng)用SYBR GreenⅠ試劑盒。每個96孔PCR 板上同一RNA 樣品重復(fù)3次，每處理進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。20μL 反應(yīng)體系含9μL cDNA 模板，10μL SYBR Green Supermix 和基因特異引物各0.5μL (終濃度230 nmol/L)。PCR 反應(yīng)程序為：95℃30 s；95℃5 s ，60℃20 s，40個循環(huán)。選用長春花40S 核糖體蛋白S9基因(RPS9基因)作為內(nèi)參對照。以2-DDCt 方法計算各基因的相對表達(dá)量。實驗所用各CrWRKY 引物以及內(nèi)參基因引物見表1。

表1 定量PCR 所用引物Table 1 Primers for qPCR

2 結(jié)果與分析

2.1 長春花CrWRKY 轉(zhuǎn)錄因子的篩選和鑒定

為鑒定長春花CrWRKY 轉(zhuǎn)錄因子，我們首先從MPGR 長春花蛋白數(shù)據(jù)庫中檢索到26009個單拷貝蛋白序列，再從中篩選出62個含有WRKY 基序的蛋白。進(jìn)一步的分析表明，這62個蛋白中有45個含有WRKYGQK 核心序列，1個含有 WRKYGKK 核心序列，1個含有WRKYGRK 核心序列(表2)。這47個可認(rèn)定為候選WRKY 家族轉(zhuǎn)錄因子，其余15個含有WRKY 基序的蛋白C 末端序列嚴(yán)重缺失，不具有典型WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的特征。隨后的NCBI CDD 和PlantTFcat 分析進(jìn)一步證實這47個蛋白均包含WRKY 結(jié)構(gòu)域，屬于WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白(楊致榮等，未發(fā)表數(shù)據(jù))。

為驗證所獲得的47個長春花CrWRKY 序列是否完整，將其全長氨基酸序列與擬南芥72個WRKY 轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行比對。結(jié)果表明47個CrWRKY 中序列最長的為731個氨基酸殘基(Cra_locus_9152)，最短的只有105個氨基酸殘基(Cra_locus_6519)。40個CrWRKY 序列含有1個WRKY 域，其余7個包含2個WRKY 域(表2)。4個序列因C 末端序列不全，缺失C 末端的鋅指結(jié)構(gòu)域(Cra_locus_2271，Cra_locus_56567、Cra_locus_19330和Cra_locus_1702)，1個序列僅含不完全的鋅指結(jié)構(gòu)域(Cra_locus_6519)(圖1)。

2.2 長春花CrWRKY 轉(zhuǎn)錄因子的序列比對和分類

圖1 CrWRKY 和代表性AtWRKY 結(jié)構(gòu)域比對分析Fig.1 Alignment of multiple CrWRKY and selected AtWRKY domain sequences.Alignment was performed with Clustal W.The suffix “N” or “C” indicates the N- or C-terminal WRKY domains of a specific WRKY protein.The amino acids forming the zinc-finger motif are highlighted in yellow.The conserved WRKY amino acid signature is highlighted in grey,and gaps are marked with dashes.For Cra_locus_1702 and 18989,upper lines show WRKY motifs and partial zinc-finger motifs using 65 amino acid sequences of the WRKY domains for alignment.Whereas,lower lines show WRKY motifs and typical zinc fingers using the first 25 AA sequences of the 65 AA sequences and the downstream 39 AA sequence beginning at the 53rd AA of the 65 AA sequence in Cra_locus_1702 and at the 65th AA in Cra_locus_18989,respectively,for alignment.

以WRKY 域65個氨基酸殘基為靶序列，將47個CrWRKY 轉(zhuǎn)錄因子和擬南芥已知的72個AtWRKY 轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行聚類分析。含有2個WRKY 域的蛋白序列分別標(biāo)注 CTWD 及NTWD，并且分別作為獨立的WRKY 蛋白來運算。結(jié)果表明，已鑒定的47個CrWRKY 轉(zhuǎn)錄因子可分為3大類(圖2)。第1類群(Group 1，G1)包括11個CrWRKY 蛋白。其中7個蛋白含有2個WRKY 域，它們的NTWD 和CTWD 分別與擬南芥第1類群的N 末端群(Group 1-N，G1-N)和C 末端群(Group1-C，G1-C)聚類在一起。其余4個含一個WRKY 域的蛋白，分別與擬南芥的G1-C 類群(Cra_locus_10348，65433和43671)和G1-N 類群(Cra_locus_2271)聚類在一起。第2類群(Group 2，G2)包括31個CrWRKY 蛋白，分別與擬南芥的G2-a、G2-b、G2-c、G2-d 和G2-e 5個亞類群聚類在一起。第3類群(Group 3，G3)包括5個CrWRKY 蛋白，全部與擬南芥的G3-a 亞類聚類在一起。值得注意的是，與擬南芥WRKY 不同，目前已鑒定的長春花WRKY 蛋白中還未發(fā)現(xiàn)G-3b 亞類成員(圖2)。

為驗證上述CrWRKY 蛋白聚類分析的準(zhǔn)確性，從上述各類群中隨機(jī)選取一個擬南芥AtWRKY 蛋白和相應(yīng)類群的CrWRKY 蛋白核心域的65個氨基酸殘基進(jìn)行序列比對。結(jié)果表明同一類群中的CrWRKY 除了WRKY 基序及鋅指結(jié)構(gòu)相同外，整個WRKY 結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基序列存在高度相似性，而且與相應(yīng)群體的AtWRKY 具有高度同源性(圖1)。這說明上述CrWRKY 的分類結(jié)果是正確的。

表2 長春花中WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族Table 2 WRKY transcription factor families in C.roseus

續(xù)表2

圖2 長春花和擬南芥WRKY 結(jié)構(gòu)域進(jìn)化關(guān)系系統(tǒng)樹Fig.2 Phylogenetic tree representing relationship among WRKY domains of C.roeus and Arabidopsis thaliana.The amino acid sequences of the WRKY domain of all CrWRKY and AtWRKY proteins were aligned with ClustalW and the phylogenetic tree was constructed using the neighbor-joining method in MEGA 5.0.Group 1 proteins with the suffix“N” or “C” indicates the N-terminal WRKY domains or the C-terminal WRKY domains.The leaf labels of WRKY members from C.roeus (Cra_locus_Nos) and Arabidopsis (AtWRKYs) are denoted in red and blue respectively.The WRKYs with similar structure clustered together are indicated by filled circle.

2.3 CrWRKY 家族WRKY 基序和鋅指結(jié)構(gòu)的保守性與多樣性

將CrWRKY 結(jié)構(gòu)域中包括WRKY 基序的25個氨基酸殘基及鋅指結(jié)構(gòu)的35個氨基酸殘基分別運用MEME 4.8.0在線軟件分析，以檢測CrWRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族中WRKY 基序和鋅指結(jié)構(gòu)的保守性與多樣性。如圖3所示，WRKYGQK基序在CrWRKY 不同成員中是高度保守的，僅在G2-c 中發(fā)現(xiàn)一些變異序列(WRKYGRK 和WRKYGKK)。與WRKY 基序高度保守性不同，鋅指結(jié)構(gòu)在不同類群CrWRKY 中差異較大。第1和第2類群成員的鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2型，其中G1-N 鋅指結(jié)構(gòu)的序列為 C-X4-C-X22-H-X1-H(圖4A)，G1-C 和 G2-c 鋅指結(jié)構(gòu)序列為C-X4-C-X23-H-X1-H (圖4B)，而G2-a、G2-b、G2-d和G2-e 的序列均為C-X5-C-X23-H-X1-H (圖4C)。第3類群成員的鋅指結(jié)構(gòu)為C2HC 型，序列為C-X7-C-X23-H-X1-C (表2，圖4D)。需指出的是，Cra_locus_2271、56567、19330和17024個CrWRKY 蛋白現(xiàn)有序列缺少C 末端序列，因而未檢出典型的鋅指結(jié)構(gòu)。需進(jìn)一步對其DNA 和RNA 進(jìn)行測序來分析這4個CrWRKY 蛋白的完整序列。Cra_locus_6519蛋白序列僅含有典型鋅指結(jié)構(gòu)的部分基序(缺少C 氨基酸殘基)(圖1)。

圖347 個CrWRKY 蛋白的WRKY 基序Fig.3 Conserved WRKY motifs in 47 CrWRKY proteins.The CrWRKY sequence used for alignment was 25 AA in length containing WRKY motifs.The bit score indicates the frequency of the amino acids at each position in the sequences.

圖447 個CrWRKY 蛋白鋅指結(jié)構(gòu)的保守性和多樣性Fig.4 Conservation and diversity of the zinc-finger motifs in 47 CrWRKY proteins.The CrWRKY sequence used for alignment was 35 AA in length containing zinc-finger motifs.The bit score indicates the frequency of the amino acids at each position in the sequences.

2.4 CrWRKY 的表達(dá)譜

基因表達(dá)模式的分析是鑒定基因功能的重要手段。為深入了解各CrWRKY 轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能，我們從MPGR 數(shù)據(jù)庫下載了47個CrWRKY 基因已有的表達(dá)數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)包括CrWRKY 在長春花根、毛狀根、莖、葉和花等不同器官，TDCi 及RebH/F 轉(zhuǎn)基因毛狀根系，以及MeJA 和YE 處理的幼苗、毛狀根和原生質(zhì)體中的表達(dá)數(shù)據(jù)。系統(tǒng)聚類和表達(dá)譜分析表明，CrWRKY 基因的表達(dá)具有器官特異性(圖5)。在根中高表達(dá)的有9個，其中3個顯著高表達(dá)(Cra_locus_6519、2271和3799)。20個CrWRKY在莖中高表達(dá)，其中10個(Cra_locus_6519、17347和4234等)顯著高表達(dá)，4個(Cra_locus_1311、3760、20290和2950)為莖特異高表達(dá)。葉片中高表達(dá)的有7個，其中3個(Cra_locus_19359、70197和4234)為顯著高表達(dá)，僅Cra_locus_70197為葉片特異高表達(dá)?；ㄆ鞴儆?個顯著高表達(dá)的 CrWRKY，其中Cra_locus_8145、549和18915為花特異表達(dá)。僅Cra_locus_4234在根、莖和葉片中均表達(dá)。

毛狀根是長春花等一些藥用植物合成積累萜類吲哚生物堿等次生代謝的重要器官。對CrWRKY 基因在長春花野生型和兩種轉(zhuǎn)基因毛狀根(TDCi 和RebH)中表達(dá)數(shù)據(jù)分析表明，超過半數(shù)的 CrWRKY 成員在毛狀根中高表達(dá)(圖5)。如野生型毛狀根中高表達(dá)的CrWRKY 有23個，TDCi 的轉(zhuǎn)基因毛狀根中26個CrWRKY高表達(dá)，RebH 轉(zhuǎn)基因毛狀根在MeJA 處理后高表達(dá)的CrWRKY 達(dá)29個。在這3種毛狀根中均高表達(dá)的CrWRKY 有11個。MeJA 處理引起野生型毛狀根中CrWRKY 上升表達(dá)有11個，減低表達(dá)的有12個。TDCi 毛狀根經(jīng)MeJA 處理后，上升表達(dá)的CrWRKY 為6個，下降表達(dá)的有11個?？梢奙eJA 處理即可上調(diào)也可下調(diào)CrWRKY在毛狀根中的表達(dá)，而且下調(diào)表達(dá)的多于上調(diào)表達(dá)的。在原生質(zhì)體中高表達(dá)的CrWRKY 有8個，MeJA 處理導(dǎo)致CrWRKY 上升表達(dá)有10個，下降表達(dá)的有3個。YE 處理原生質(zhì)體則誘導(dǎo)11個CrWRKY 上升表達(dá)，僅2個下降表達(dá)。與MeJA處理毛狀根對CrWRKY 表達(dá)影響不同，MeJA 和YE 處理原生質(zhì)體誘導(dǎo)CrWRKY 上升表達(dá)的數(shù)目明顯高于下降表達(dá)的。

表達(dá)譜系統(tǒng)聚類分析將47個CrWRKY 表達(dá)譜劃分為3種不同表達(dá)模式(圖5)：第1組(Group 1) CrWRKY 主要在花和MeJA 或YE 處理的懸浮培養(yǎng)的原生質(zhì)體中高表達(dá)，如Cra_locus_13321、22725和10348等；第2組(Group 2) CrWRKY 蛋白主要在莖、毛狀根(野生型毛根、轉(zhuǎn)基因TDCi 毛根和轉(zhuǎn)基因RebH/F毛根)和受MeJA 處理的毛狀根中高表達(dá)(如Cra_locus_1311、6088、11684、16307、21821和2950等)，其中少數(shù)在原生質(zhì)體中高表達(dá)且受MeJA 誘導(dǎo)(如Cra_locus_5497、19330和22395等)；第3組(Group 3)主要在根、莖、葉、幼苗和毛狀根及受MeJA 處理的毛狀根中高表達(dá)，但在原生質(zhì)體中低表達(dá)且不受MeJA 誘導(dǎo)(如Cra_locus_6519、17347和7867等)。

圖5 長春花中的47個CrWRKY 基因在不同組織器官和不同處理條件下的表達(dá)譜聚類分析Fig.5 Hierarchical clustering and expression profiles of the 47 CrWRKYs in different organs/tissues and under various treatments in C.roseus.Blocks with colors indicate low/down expression (blue),high/up expression (red) or no expression/no change (black).WT,wild-type;RebH,flavin-dependent halogenase;TDCi:tryptophan decarboxylase gene silenced by RNAi.

進(jìn)一步的分析表明，部分蛋白序列聚類在一起的CrWRKY 成員，其表達(dá)模式也類似，但不完全吻合。 G2-c 亞類 CrWRKY 的Cra_locus_105225、22395和19330的表達(dá)譜極相似，同劃在第2組表達(dá)模式。G2-c 的Cra_locus_43896和37309表達(dá)譜相近，劃在第3組表達(dá)模式。 G2-e 亞類 CrWRKY 的Cra_locus_21821和16307表達(dá)譜亦相似，劃在第2組表達(dá)模式。表達(dá)譜相似的 G1大類CrWRKY 的Cra_locus_549和8145劃在第1組表達(dá)模式。但同在G1大類群的Cra_locus_13321、9152和4234的表達(dá)模式分別劃分在第1、2和3組。

2.5 CrWRKY 表達(dá)模式的驗證

為驗證上述基于數(shù)據(jù)庫已有表達(dá)數(shù)據(jù)系統(tǒng)分析所揭示的CrWRKY 轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)模式，我們先選取5個在不同器官表達(dá)差異較大的CrWRKY 轉(zhuǎn)錄因子，應(yīng)用實時定量PCR 檢測它們的表達(dá)情況。其中 Cra_locus_2271、Cra_locus_20290、 Cra_locus_70197和Cra_locus_8145分別在根、莖、葉和花器官顯著高表達(dá)。定量 PCR 檢測結(jié)果表明，這4個CrWRKY 在所檢測器官中表達(dá)量高低與上文數(shù)字基因表達(dá)譜表達(dá)分析結(jié)果基本一致(圖6A)。數(shù)字基因表達(dá)譜和定量 PCR 數(shù)據(jù)均顯示Cra_locus_1702在根和莖中表達(dá)量相似，盡管表達(dá)量不是很高，但顯著高于在葉片和花中的表達(dá)(圖5和6A)。

上述數(shù)字基因表達(dá)譜分析還顯示，許多CrWRKY 基因的表達(dá)受MeJA 和YE 的調(diào)控。為驗證這些CrWRKY 轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)模式，我們用MeJA 分別處理長春花原生質(zhì)體和無性系毛狀根。原生質(zhì)體分別在處理后0、6、12和24 h 取樣。無性系毛狀根在處理后0、12和24 h 取樣。提取總RNA，用qPCR 檢測所選取的CrWRKY基因的表達(dá)情況。用qPCR 檢測MeJA 處理原生質(zhì)體樣品中 Cra_locus_13321、24943、1311、13263、18989和8670等6個CrWRKY 基因表達(dá)的結(jié)果表明，Cra_locus_13321、24943、1311、13263、18989五個基因受MeJA 誘導(dǎo)，它們的表達(dá)模式基本與數(shù)字基因表達(dá)譜所揭示一致，其表達(dá)峰值和時態(tài)變化有較大差異。而數(shù)字基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析表明Cra_locus_8670不受MeJA 的影響，qPCR 結(jié)果表明該基因受MeJA 誘導(dǎo)，呈上升表達(dá)，但上升幅度很小(圖6B)。依據(jù)數(shù)字基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，從毛狀根受MeJA 誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)生變化的CrWRKY 基因中，分別選取3個上升表達(dá)(Cra_locus_24943、11684和30069)和減低表達(dá)(Cra_locus_9152、6519和19580) WRKY 基因作為檢測靶標(biāo)。如圖6C 所示，與數(shù)字基因表達(dá)譜分析結(jié)果不同，MeJA 處理毛狀根并未引起Cra_locus_30069上升表達(dá)和Cra_locus_19580下降表達(dá)，而是導(dǎo)致2個CrWRKY 呈現(xiàn)相反表達(dá)模式。其余4個CrWRKY 基因受MeJA 影響，在毛狀根中表達(dá)量發(fā)生顯著變化，表達(dá)模式與數(shù)字基因表達(dá)譜分析所揭示的基本一致。

3 討論

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族含有眾多成員，其蛋白結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能具有多樣性。鑒定WRKY 轉(zhuǎn)錄因子種類及數(shù)量是深入研究其生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。本研究從長春花的26009個蛋白中篩選鑒定出47個CrWRKY 轉(zhuǎn)錄因子(表2，圖2)，約占蛋白總數(shù)的0.18%。而在擬南芥(72個)、水稻(109個)和玉米(136個)基因組中這一比例分別為0.26%、0.41%和0.42%。無論從WRKY的總數(shù)還是所占比例來說，長春花都遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于上述3種植物。這可能是在進(jìn)化過程中擬南芥、水稻和玉米基因組中WRKY 基因發(fā)生了更多的基因復(fù)制事件，導(dǎo)致WRKY 基因的快速擴(kuò)張[12,20]，而在長春花中CrWRKY 基因單拷貝居多。但由于長春花全基因組測序還未完成，因此不排除一些CrWRKY 基因還未被發(fā)現(xiàn)的可能。

圖6 代表性CrWRKY 基因表達(dá)模式的qPCR 驗證Fig.6 Expression verification of the selected CrWRKY genes revealed by qPCR.(A) Expression patterns of five selected CrWRKY genes in various organs.(B) Expression patterns of six selected CrWRKY genes in MeJA-treated protoplasts.(C) Expression patterns of six selected CrWRKY genes in MeJA-treated hair roots.For real-time PCR,the relative expression of mRNA (y-axis) was calculated according to the description in materials and methods.The RPS9 gene was used as an internal control to normalize the data.Error bars are standard deviations of three biological replicates.Stars above the bars indicate statistically significant increases or decreases compared with the un-treated control (P<0.05,t test).

依據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)，高等植物WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族一般分為3個大類和8個亞類[1,11]，本研究通過與擬南芥AtWRKY 蛋白序列比較，以及系統(tǒng)聚類和WRKY 域基序保守性等分析，將47個CrWRKY 也分為相似的類群，即G1、G2(G2-a、b、c、d 和e)和G3(G3-a)，但無G3-b 成員(圖1、圖2及表2)。依其蛋白序列分析，推測Cra_locus_10348等3個CrWRKY 可能起源于具有2個WRKY 域的家族成員，在進(jìn)化過程中丟失1個WRKY 域。G1類群成員WRKY 域丟失的現(xiàn)象也在擬南芥和玉米等基因組中發(fā)生。如擬南芥G1成員AtWRKY10只包括1個WRKY域[20]，玉米G1類群中16個成員僅含有1個WRKY 域[21]。有關(guān)WRKY 家族進(jìn)化研究認(rèn)為，編碼1個WRKY 域的基因是從編碼2個WRKY域的基因進(jìn)化而來，且C 末端WRKY 域相當(dāng)保守，在決定DNA 結(jié)合過程中起主導(dǎo)作用[12]。換句話說，N 末端WRKY 域在進(jìn)化過程中常發(fā)生丟失。這也可解釋，已檢測WRKY 基因的高等植物中，具有1個WRKY 域的WRKY 蛋白數(shù)量遠(yuǎn)大于具有2個WRKY 域蛋白數(shù)量。

擬南芥和水稻等植物的G3類群WRKY不僅數(shù)目多(擬南芥11個，占20%和水稻36個，占30%)，而且基因擴(kuò)增明顯。例如，水稻G3-a 和G3-b 分別有10和26個OsWRKY 成員[12]，且WRKY 域保守序列變異大于G1和G2類群的OsWRKY。G3類群的OsWRKY 擴(kuò)增與基因復(fù)制相關(guān)。Zhang 等[13]報道，在單、雙子葉植物發(fā)生歧化(約160 Mya 前)后，G3類群WRKY 開始獨立復(fù)制。Ling 等[20]進(jìn)一步證實，擬南芥、水稻和大豆的G3類群WRKY的擴(kuò)增是進(jìn)化上近期(24～40 Mya)基因組復(fù)制的結(jié)果。與之不同的是，長春花CrWRKY G3類群僅有5個成員，全聚類為G3-a 亞類。顯然，長春花G3類群WRKY無擴(kuò)增現(xiàn)象，這與黃瓜基因組中G3類群WRKY(6個成員)情形類似[20]。類似的，裸子植物松樹Pinus monticola 中編碼83個PmWRKY 蛋白，但亦未檢出G3類群成員[10]。可見，G3類群WRKY 在植物進(jìn)化過程中變異較大，暗示了在不同種屬植物中該類群成員的功能有較高的歧化性。

此外，對47個CrWRKY 蛋白的WRKY 域保守基序的分析顯示，WRKYGQK 是WRKY 基因最保守的基序，僅在G2-c 中發(fā)現(xiàn)一些變異序列(如WRKYGRK 和WRKYGKK)(圖1)。然而，鋅指結(jié)構(gòu)基序在序列長短和結(jié)構(gòu)上差異較大。與其他類群CrWRKY 蛋白C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)不同，G3類群WRKY 鋅指結(jié)構(gòu)為C2HC 型。這反映了不同類型的WRKY 基因的所經(jīng)歷選擇壓力和進(jìn)化模式是不同的。

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在植物抵御多種生物脅迫和逆境反應(yīng)中起著重要的作用[22-24]。本研究也發(fā)現(xiàn)，約1/3 CrWRKY 基因的表達(dá)受MeJA 和YE調(diào)控。大量研究表明，YE 能誘導(dǎo)多種參與植物抵御病原菌侵襲的基因表達(dá)，而MeJA 直接參與植物對生物脅迫和非生物脅迫的防衛(wèi)反應(yīng)。眾多CrWRKY 的表達(dá)受MeJA 和YE 調(diào)控，預(yù)示著這些CrWRKY 可能參與長春花植株抵御病原菌等生物脅迫以及非生物脅迫反應(yīng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。此外，這些CrWRKY 亦可能在長春花萜類吲哚生物堿(TIAs)的生物合成及代謝中起重要作用，因為長春花萜類吲哚堿的生物合成受YE 和MeJA等植物激素誘導(dǎo)。最近，Suttipanta 等[25]克隆和鑒定了一個長春花WRKY 轉(zhuǎn)錄因子CrWRKY1(即本文的Cra_locus_16284)，該WRKY 在根中特異高表達(dá)，且受MeJA、赤霉素和乙烯的誘導(dǎo)，過量表達(dá)CrWRKY1使根中蛇根堿的含量提高了3倍多。這與本文該轉(zhuǎn)錄因子主要在毛狀根中高表達(dá)和受MeJA 誘導(dǎo)的研究結(jié)果一致。

如上所述毛狀根是長春花等一些藥用植物合成積累萜類吲哚生物堿等次生代謝物的重要器官，而且長春花遺傳轉(zhuǎn)化體系目前多采用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的毛狀根體系。因此，分析長春花毛狀根中CrWRKY 表達(dá)譜有助于認(rèn)識毛狀根中萜類吲哚生物堿等次生代謝物合成調(diào)控機(jī)制。TDC是萜類吲哚生物堿生物合成的一個關(guān)鍵酶，催化色氨酸生成萜類吲哚生物堿生物合成的起始底物即色胺。RebH/F 是催化色胺生成鹵代色胺(另一種供生物堿合成的前體物質(zhì))的關(guān)鍵酶。長春花TDCi 轉(zhuǎn)基因毛狀根是RNA 介導(dǎo)TDC 基因沉默的毛狀根，該毛狀根中色胺含量明顯減少。長春花RebH/F 轉(zhuǎn)基因毛狀根能合成鹵代色胺。顯然這兩種長春花轉(zhuǎn)基因毛狀根中用于生物堿生物合成的前體物質(zhì)發(fā)生較大變化。我們先期對已知的一些參與萜類吲哚生物堿生物合成的關(guān)鍵酶基因啟動子分析發(fā)現(xiàn)，幾乎所有啟動子都含WRKY 轉(zhuǎn)錄因子特異結(jié)合的元件W-box，其中TDC 啟動子包含有4個W-box，這暗示長春花CrWRKY 轉(zhuǎn)錄因子可能參與TIAs 合成途徑的調(diào)控。為此，本文比較分析野生型毛狀根與這兩種轉(zhuǎn)基因毛狀根中CrWRKY 基因表達(dá)譜，以期進(jìn)一步解析CrWRKY 參與萜類吲哚生物堿生物合成的調(diào)控作用，為發(fā)現(xiàn)更多的參與調(diào)控萜類吲哚生物堿生物合成的WRKY 轉(zhuǎn)錄因子，特別是響應(yīng)體內(nèi)不同前體物質(zhì)的WRKY 提供科學(xué)依據(jù)。表達(dá)譜分析結(jié)果(圖5)顯示，除了少數(shù)CrWRKY (如Cra_locus_6519和 Cra_locus_16307等)在這3種毛狀根中均高表達(dá)外，多數(shù)CrWRKY (如 Cra_locus_1311、Cra_locus_9152和Cra_locus_13760等)在這3種毛狀根間表達(dá)量發(fā)生顯著變化，表明這些CrWRKY 可能參與對毛狀根中生物堿生物合成的前體物質(zhì)變化的響應(yīng)以及下游某些生物堿合成積累的調(diào)控。

為進(jìn)一步驗證數(shù)字基因表達(dá)譜分析所揭示的CrWRKY 表達(dá)模式，我們選取16個CrWRKY為靶標(biāo)，用qPCR 檢測它們在不同器官，以及在MeJA 處理的原生質(zhì)體和毛狀根中的表達(dá)。結(jié)果顯示，絕大多數(shù)所測CrWRKY 表達(dá)模式與數(shù)字基因表達(dá)譜分析結(jié)果基本吻合(圖5、6)。只有2個CrWRKY 表達(dá)模式的qPCR 和數(shù)字基因表達(dá)譜分析結(jié)果不一致。這兩種表達(dá)分析數(shù)據(jù)還顯示，除CrWRKY1，其他一些CrWRKY 也可能參與TIA 生物合成途徑的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。深入研究這些CrWRKY 的生物學(xué)功能，將為全面解析長春花TIAs 生物合成的調(diào)控機(jī)制和提高長春花抗癌生物堿生物合成的代謝工程策略提供有益的信息。

一些研究認(rèn)為，蛋白序列結(jié)構(gòu)相近的WRKY轉(zhuǎn)錄因子，常有類似的表達(dá)模式，行使相似的生物學(xué)功能[26-27]。然而，我們的表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析顯示同一類群(或亞類)的CrWRKY 成員多數(shù)的表達(dá)模式不完全一致。這意味著結(jié)構(gòu)相似的CrWRKY 成員，它們的表達(dá)模式和功能也可能是相異的。這正是WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族的典型特征，即WRKY 結(jié)構(gòu)域高度保守和功能多樣性。因此，未來需進(jìn)行更多詳盡研究，以全面認(rèn)識本文所鑒定的47個CrWRKY 成員的具體生物學(xué)功能和調(diào)控靶基因或目標(biāo)代謝途徑表達(dá)的分子機(jī)理。

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