張佳佳，李會，李恒，陸震鳴，史勁松，許正宏

江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇無錫 214122

黃姜[Dioscorea zingiberensis C.H.Wright(DZW)]是我國特有的薯蕷科薯蕷屬植物，其根莖含有的薯蕷皂苷是生產(chǎn)薯蕷皂苷元的重要原料之一[1]。薯蕷皂苷元是合成多種甾體類藥物的重要中間體，主要以薯蕷皂苷配體的形式存在于薯蕷科等植物根莖內(nèi)[2]。傳統(tǒng)的生產(chǎn)薯蕷皂苷元的方法包括酸解法、自然發(fā)酵法、酶解法、萃取法等[3]。工業(yè)上普遍使用的酸解法帶來嚴(yán)重的環(huán)境污染和資源浪費。近年來，研究人員針對薯蕷皂苷元生產(chǎn)中存在的問題做了一系列的改進(jìn)，如熱處理剝離黃姜中的淀粉和纖維素，干燥后直接提取[4]；微波輔助雙水相提取[5]；以及微生物轉(zhuǎn)化法切斷薯蕷皂苷中的糖苷鍵，釋放薯蕷皂苷元等[6]。

與酸解法相比微生物轉(zhuǎn)化法具有低成本、強選擇性、易于控制反應(yīng)條件等特點，而且大幅度降低了廢水中BOD、COD、H+、SO42?。Feng 等[7]利用新月彎孢霉轉(zhuǎn)化黃姜中皂苷，并從轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷元、薩爾薩皂苷元、知母皂苷等；Zhu等[8]利用里氏木霉將黃姜中皂苷轉(zhuǎn)化為薯蕷皂苷元，轉(zhuǎn)化時間為6.5 d，產(chǎn)率為(30.4±1.54) mg/g DZW。但是仍面臨著副產(chǎn)物多、前處理復(fù)雜和轉(zhuǎn)化周期較長等問題。

為解決以上問題，從本實驗室保藏的菌種庫中篩選能將黃姜中的皂苷轉(zhuǎn)化為薯蕷皂苷元且副產(chǎn)物少的微生物。在此基礎(chǔ)上，利用統(tǒng)計實驗方法Plackett-Burman (PB)和響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化培養(yǎng)基，以期為生物轉(zhuǎn)化制備薯蕷皂苷元方法的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

本研究使用的菌株均來自實驗室保藏庫。

1.1.2 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基(g/L)：硝酸鈉3，磷酸二氫鉀1，七水硫酸鎂0.5，氯化鉀0.5，七水硫酸亞鐵0.01，黃姜皂苷3，瓊脂20，自然pH。

基礎(chǔ)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10，酵母膏7.5，氯化鈉1，磷酸二氫鉀3，七水硫酸鋅1，黃姜提取物3，pH 7.0。

1.1.3 主要材料與試劑

黃姜購自湖北省鄖西縣；淀粉酶(20000 U/mL)、糖化酶(100000 U/mL)購自江蘇諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司。其他試劑來自國藥化學(xué)試劑有限公司。

1.1.4 主要實驗儀器

UV1700紫外-可見光分光光度計購自天津天光公司；HYL-C 組合式搖床購自太倉強樂實驗設(shè)備有限公司；Ultimate 3000高效液相色譜儀購自戴安公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種初篩

將實驗室保藏的36株微生物分別接種至液體察氏培養(yǎng)基進(jìn)行種子培養(yǎng)2 d，分別吸取100μL 均勻涂布于篩選培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)2 d，挑選能在篩選培養(yǎng)基表面生長的微生物[1]。

1.2.2 菌種復(fù)篩

將初篩菌株接種到液體基礎(chǔ)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，30℃、200 r/min 培養(yǎng)7 d，設(shè)不接種微生物的為空白對照。取50 mL 轉(zhuǎn)化液離心取沉淀，并加20 mL石油醚超聲提取4 h[3-4]。采用TLC 和HPLC 檢測提取液中的薯蕷皂苷元，與空白和標(biāo)準(zhǔn)品比較。

1.2.3 薄層層析(TLC)檢測法

采用硅膠預(yù)制板，展開劑是99%氯仿：1%甲醇，顯色劑為5%香草醛硫酸溶液，點樣量5μL，105℃加熱5 min 顯色。

1.2.4 高效液相色譜(HPLC)檢測法

C18反相柱(Agilent TC-C18，4.6 mm×150 mm，5μm)；流動相為90%乙腈：10%水；流速1 mL/min；柱溫為室溫；紫外檢測波長203 nm；進(jìn)樣量10μL。

1.2.5 黃姜的預(yù)處理方法對薯蕷皂苷元產(chǎn)量的影響

無水乙醇提取法：100 g 干黃姜粉末加入1 L無水乙醇，回流提取8 h，過濾，濾液蒸干得到醇溶皂苷。

直接酶解法：100 g 干黃姜粉，加入2 L 水中煮沸1 h。加入淀粉酶1 mL 和糖化酶4 mL，60℃溫育8 h。離心取沉淀，烘干[8-9]。

預(yù)處理酶解法：稱取鮮黃姜312 g (合100 g 干黃姜)粉碎磨漿，重復(fù)洗滌過濾。濾液靜置后取中層懸濁液，加入淀粉酶1 mL 和糖化酶4 mL，60℃酶解6 h，離心取沉淀烘干[10]。

按照以上3種方法處理黃姜，將得到的固體作為轉(zhuǎn)化底物分別加入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，比較不同黃姜預(yù)處理方式對薯蕷皂苷元產(chǎn)量的影響。

1.2.6 優(yōu)化方法

設(shè)計Plackett-Burman 實驗，考察培養(yǎng)基各組分對薯蕷皂苷元產(chǎn)率影響的顯著性；設(shè)計影響最顯著因素的最陡爬坡實驗，根據(jù)實驗結(jié)果確定響應(yīng)面實驗的因素和水平。使用design expert 設(shè)計響應(yīng)面實驗，通過對結(jié)果進(jìn)行分析得到優(yōu)化培養(yǎng)基組成[11-12]。進(jìn)行最優(yōu)條件下的發(fā)酵轉(zhuǎn)化驗證實驗，首先將赤霉菌WX12接種至液體察氏培養(yǎng)基進(jìn)行種子培養(yǎng)24 h，然后將種子接種至優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d，每12 h 取轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基離心取沉淀，石油醚超聲提取，檢測不同時間石油醚提取液中薯蕷皂苷元的產(chǎn)率。確定薯蕷皂苷元最高產(chǎn)率的時間，重復(fù)發(fā)酵轉(zhuǎn)化驗證試驗3次。

2 結(jié)果

2.1 菌種篩選

經(jīng)過初篩，挑選得到7株能生長的菌株。繼而將初篩獲得的微生物接種到液體基礎(chǔ)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7 d 后通過TLC 和HPLC 檢測進(jìn)行復(fù)篩。TLC 檢測提取液中的薯蕷皂苷元(圖1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)赤霉菌Gibberella intermedia WX12的轉(zhuǎn)化液中含有薯蕷皂苷元。圖2為薯蕷皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品與赤霉菌轉(zhuǎn)化液的HPLC 圖譜，可以看出，轉(zhuǎn)化液的HPLC圖譜中有與標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間一致的物質(zhì)峰，證實了轉(zhuǎn)化液中薯蕷皂苷元的存在。因此選擇赤霉菌作為轉(zhuǎn)化菌株。

2.2 黃姜前處理

干黃姜100 g 通過乙醇提取、直接酶解、預(yù)處理酶解分別可以得到轉(zhuǎn)化底物7.10 g、56.2 g 和10.1 g。將這3種轉(zhuǎn)化底物加入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，使用赤霉菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化試驗可以分別得到薯蕷皂苷元(2.0±0.1)、(11.9±0.2)、(3.1±0.1) mg/g DZW。因此使用直接酶解法作為黃姜前處理方法。

圖1 發(fā)酵產(chǎn)物薄層層析(TLC)色譜圖Fig.1 Thin layer chromatogram of fermentation sample.1:standard;2:fermentation sample.

2.3 PB 實驗設(shè)計結(jié)果與分析

利用design expert 軟件進(jìn)行PB 實驗設(shè)計，考察培養(yǎng)基的5個組分對薯蕷皂苷元產(chǎn)率的影響。表1顯示葡萄糖、酵母膏和硫酸鋅對薯蕷皂苷元產(chǎn)率影響顯著。其中正向影響因子是葡萄糖和硫酸鋅，負(fù)向影響因子為酵母膏，可信度＞95%。

2.4 最陡爬坡實驗結(jié)果

根據(jù)PB 實驗結(jié)果篩選出3個主要因素的效應(yīng)和大小比例，設(shè)定變化方向及步長，進(jìn)行最陡爬坡實驗。根據(jù)實驗結(jié)果找出逼近薯蕷皂苷元最高產(chǎn)率的區(qū)域，將其作為響應(yīng)面實驗因素水平的中心點。通過最陡爬坡實驗，得到薯蕷皂苷元產(chǎn)率達(dá)到(19.2±0.2) mg/g DZW。

2.5 響應(yīng)面實驗結(jié)果

利用design expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面實驗設(shè)計，并進(jìn)行回歸分析和方差分析，擬合得到回歸方程：

圖2 標(biāo)樣(A)和赤霉菌發(fā)酵產(chǎn)物(B)的HPLC 分析圖Fig.2 HPLC chromatograms of diosgenin standard (A)and fermention sample (B).

表1 試驗設(shè)計的因子水平及效應(yīng)評價Table 1 Factors levels and efficiency evaluation of experimental design

表2 回歸模型的方差分析Table 2 Variance analysis of parameters in regression modle

Y=?112.0599+7.8988A+0.8656B+41.6125C?0.01AB?0.1313AC+0.6875BC?0.1856A2?0.1699B2?13.9313C2。

從回歸方程和表2以看出，回歸模型大于F 值的概率為0.0008，說明此模型的可信度較高。由可信度分析可以得到復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9515，校正后R2=0.8891，也說明了該模型的可信度較高。對回歸方程求導(dǎo)得到培養(yǎng)基組分(g/L)為：葡萄糖20.6；酵母膏5.0；氯化鈉1；磷酸二氫鉀3；硫酸鋅1.5；黃姜酶解物3；預(yù)測值：31.1 mg/g DZW。

根據(jù)不同時間的薯蕷皂苷元產(chǎn)率結(jié)果得到轉(zhuǎn)化5 d 后薯蕷皂苷元的產(chǎn)率最高，因此將轉(zhuǎn)化時間定為5 d。根據(jù)響應(yīng)面的結(jié)果進(jìn)行3次發(fā)酵轉(zhuǎn)化驗證實驗，最后測得薯蕷皂苷元產(chǎn)率為30.8、31.3、30.8 mg/g DZW，平均值是(31.0±0.3) mg/g DZW，比優(yōu)化前提高了3倍。實驗值與預(yù)測值相差較小，說明該模型能較好地反映實際轉(zhuǎn)化情況。

3 結(jié)論

本研究為首次報道赤霉菌Gibberella intermedia能將黃姜中的皂苷轉(zhuǎn)化為薯蕷皂苷元。采用統(tǒng)計學(xué)設(shè)計方法-PB 實驗和響應(yīng)面實驗對培養(yǎng)基優(yōu)化，確定了最優(yōu)培養(yǎng)配方。利用優(yōu)化的培養(yǎng)基配方，薯蕷皂苷元的產(chǎn)率提高到(31.0±0.3) mg/g DZW，較優(yōu)化前提高了3倍。

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