胡清林* 何澤友 徐成飛 鄢傳經(jīng) 嚴(yán) 海

（成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普通外科一區(qū)，四川 成都 610500）

PCR二次擴(kuò)增法監(jiān)測乳腺癌微轉(zhuǎn)移的價(jià)值探討

胡清林* 何澤友 徐成飛 鄢傳經(jīng) 嚴(yán) 海

（成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普通外科一區(qū)，四川 成都 610500）

目的 探索 PCR 二次擴(kuò)增法對乳腺癌細(xì)胞外周血微轉(zhuǎn)移診斷的應(yīng)用價(jià)值。方法 分離受檢者外周血單個(gè)核細(xì)胞，TRIZOL 液提取總RNA，作 RT-PCR；確認(rèn)的 cDNA 先作普通 PCR 擴(kuò)增，再作熒光定量 PCR 擴(kuò)增。結(jié)果 42 例標(biāo)本有 41 例確認(rèn)轉(zhuǎn)錄為 cDNA，其中乳腺癌 21 例、良性乳腺腫瘤和正常對照各 10 例。經(jīng)普通 PCR 后再作熒光定量 PCR，乳腺癌 HMAM 表達(dá)陽性率為 59%、良性乳腺腫瘤和正常對照均無陽性，乳腺癌組與良性乳腺腫瘤或正常對照組間 hMAM 表達(dá)有顯著差異。結(jié)論 二次 PCR 的靈敏度可成功檢出外周血 hMAM 的表達(dá)，而單次 PCR 法的靈敏度不夠；外周血 hMAM 表達(dá)指標(biāo)可用于監(jiān)測乳腺癌細(xì)胞微轉(zhuǎn)移。

乳腺癌；人乳房珠蛋白；RT-PCR；外周血

乳腺癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢，盡管在早期診斷和綜合治療方面取得了長足發(fā)展，但肉眼不可見的腫瘤轉(zhuǎn)移仍嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。人乳房珠蛋白（human mammaglobin，hMAM）作為與乳腺癌密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，在最近才被研究機(jī)構(gòu)發(fā)現(xiàn)[1]，若是表達(dá)出外周血hMAM陽性，乳腺癌細(xì)胞的微轉(zhuǎn)移即高度提示，故此指標(biāo)特異性價(jià)值較高。在臨床上，通過外周血對乳腺癌細(xì)胞微轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)情況進(jìn)行監(jiān)測和復(fù)發(fā)較難，且能實(shí)現(xiàn)該監(jiān)測的方法屈指可數(shù)。而外周血微轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞其表達(dá)可以RT-PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)靈敏檢測[2]。本次研究其實(shí)驗(yàn)材料為外周血，擇取特異的hMAM表達(dá)作為定位指標(biāo)，檢測對象為乳腺癌患者，以期探索一條監(jiān)控乳腺癌細(xì)胞外周血微轉(zhuǎn)移的優(yōu)良臨床途徑。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

本次研究納入病例樣本共計(jì)42人。其中22人為女性乳腺癌患者，年齡在28～65歲間，平均50.8歲。10人為女性良性乳腺腫瘤患者，年齡在19～63歲間，平均47.2歲。10人為健康女性，年齡在24～63歲間，平均48.9歲。按照病理診斷結(jié)果為患者分類。

1.2 試劑儀器

采用上海華美公司生產(chǎn)的的淋巴細(xì)胞分離液、TRIZOL總RNA提取液、RT—PCR及PCR反應(yīng)試劑。采用上海生工生物技術(shù)公司生產(chǎn)的DNA marker。委托上海申友生物技術(shù)公司合成引物和熒光探針。PTC一200擴(kuò)增儀系美國產(chǎn)、熒光定量PCR擴(kuò)增儀系德國產(chǎn)、凝膠成像分析系統(tǒng)系美國GIBCO公司產(chǎn)。綜上設(shè)備進(jìn)行本次實(shí)驗(yàn)。

1.3 標(biāo)本配置

在手術(shù)前后1日內(nèi)采集5mL本次所有腫瘤樣本患者的外周血，并打入內(nèi)置EDTA抗凝的一次性管中行hMAM檢測。

1.4 總RNA提取

單個(gè)核細(xì)胞的提取以淋巴細(xì)胞分離液實(shí)現(xiàn)，而后將核細(xì)胞置入Eppendorf管（無RNase）中，以-80℃環(huán)境貯存。若需開始檢測，應(yīng)預(yù)先取出并化凍。提取總RNA需向管內(nèi)加TRIZOL液（詳細(xì)步驟以使用說明書為參考）。

1.5 陽性模板獲取

116bp片段的DNA片段系本引物的擴(kuò)增產(chǎn)物，將這些片段稀釋成不同濃度梯度，用作陽性模板。

1.6 RT-PCR驗(yàn)證

RT—PCR Kit的β-actin引物（5’-GCTCGTCGTCGACAACGGCT一3’、5’一CAAACATGATCT—GGGTCATCITCTC-3’）和反應(yīng)體系擴(kuò)增β-actin，以確驗(yàn)是否已成功提取總RNA并測定RT-PCR效率。cDNA 5μL含于25μL的總反應(yīng)體系內(nèi)，并以普通PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增處置，擴(kuò)增條件：94℃ 2min預(yù)變性，94℃ 15S、55℃ 30S共40循環(huán)，72℃ 1min延伸。在2%的瓊脂糖膠中，行擴(kuò)增產(chǎn)物電泳，明亮條帶現(xiàn)于353 bp處判定陽性。

1.7 以實(shí)時(shí)熒光定量PCR直接檢測RT-PCR產(chǎn)物

cDNA產(chǎn)物10μL、Taq酶1μL、PCR buffer 14μL（含一對引物和熒光探針）、合計(jì)25μL。以上物質(zhì)行熒光定量擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：94℃ 2min預(yù)變性，94℃ 5S、60℃ 30S共40循環(huán)，37℃ 5 min延伸。行陽、陰性比照對應(yīng)陽性模板和無菌水。軟件自動分析反應(yīng)后數(shù)據(jù)，擴(kuò)增陽性系Ct＜37。

1.8 RT-PCR先行擴(kuò)增復(fù)以實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

首輪擴(kuò)增在引物變更為hMAM引物、擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為25循環(huán)的前提下，余參照1.6。次輪熒光擴(kuò)增處置參照1.7。以首輪產(chǎn)物2μL為模板，無菌水補(bǔ)足總體積至25μL。陰、陽性比照同前。軟件自動分析反應(yīng)后數(shù)據(jù)，擴(kuò)增陽性系Ct＜37。1.9 以SPSS 13.0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié) 果

2.1 驗(yàn)證RT-PCR結(jié)果

以1.6實(shí)驗(yàn)處置流程、分子量標(biāo)準(zhǔn)參照DNA marker，若明亮條帶現(xiàn)于353 bp處判定陽性則判定RT-PCR成功。在共計(jì)實(shí)驗(yàn)樣本42例中，1例呈β-actin陰性，陰性提示RNA已被降解，余為陽性、提示目的cDNA已獲取。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測RT-PCR產(chǎn)物結(jié)果

參照實(shí)驗(yàn)流程1.7，進(jìn)行陰性和陽性對照均符合，其中2例樣本其Ct值起跳于大于37處，但不存在Ct＜37樣本。

2.3 RT-PCR先行擴(kuò)增復(fù)以實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果參照實(shí)驗(yàn)流程1.8，結(jié)果見表1。

表1 42例標(biāo)本hMAM 基因外周血表達(dá)的檢測結(jié)果

3 討 論

腫瘤復(fù)發(fā)在癌細(xì)胞外周血微轉(zhuǎn)移上有高概率預(yù)示。目前在臨床上極少有能測出癌細(xì)胞外周血微轉(zhuǎn)移的可行性有效方法，故實(shí)現(xiàn)外周血乳腺癌微轉(zhuǎn)移的監(jiān)測異常艱難。熒光定量PCR系統(tǒng)其熒光探針具高度特異性，只結(jié)合被擴(kuò)增的特異性目的片段并同時(shí)發(fā)出熒光信號，故其靈敏度及特異性價(jià)值極高。資料顯示[3]，臨床多只以常規(guī)定性巢式或熒光定量巢式行hMAM cDNA擴(kuò)增。本次研究的對照方案按照臨床主流方案效仿，僅陽性對照呈陽性。雖有2例Ct值＞37時(shí)的起跳樣本，但皆不呈陽性。若是RT-PCR先行擴(kuò)增、再以實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，其hMAM表達(dá)在21名乳腺癌患者中，檢出59%的陽性率。這清楚地揭示了微轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞在外周血中呈極微量，PCR技術(shù)縱然具有高靈敏度，hMAM表達(dá)的檢出仍需行二次擴(kuò)增。

本次研究結(jié)果顯示，hMAM表達(dá)在乳腺癌組呈59%的陽性率，該結(jié)果與良性腫瘤組、健康對照組間差異明顯，這說明了RT-PCR在檢出外周血中乳腺癌細(xì)胞微轉(zhuǎn)移的可行性，也說明hMAM表達(dá)指標(biāo)具特異性。這59%的陽性率，與其他文獻(xiàn)相比稍高[3]，這可能因?yàn)椋孩俦窘M外周血樣本采集較早，而未經(jīng)臨床處置時(shí)患者其血液內(nèi)所含癌細(xì)胞數(shù)量較高，采集量自然偏高；②本次研究為普通PCR擴(kuò)增與實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增的聯(lián)合應(yīng)用，故提升了綜合檢測的靈敏度，常規(guī)檢測中本應(yīng)遺漏的陽性靶向物在本方案中被成功捕捉；③mRNA若受到污染極易降解，本次研究中1例β-actin檢測陰性，有很大概率系RNA在提取過程中被降解，其余樣本均為β-actin擴(kuò)增陽性，其cDNA被逆轉(zhuǎn)錄得到了確認(rèn)。為此，部分結(jié)果未納入RT-PCR監(jiān)控報(bào)道結(jié)果，而低陽性率有很大概率是因?yàn)镽NA在前處理時(shí)被降解。

綜上所述，hMAM表達(dá)檢測采用二次PCR擴(kuò)增來提高靈敏度，對乳腺癌細(xì)胞的微轉(zhuǎn)移檢測效果確切，值得在臨床上應(yīng)用和推廣。

[1]Watson MA,Fleming Tp. Mammaglobin a mammary- specific member of the uterglobin gene family is over expressed in human breast cancer[J].Cancer Res,1996,56(4):860-865.

[2]劉寧,張偉,郝希山,等.熒 光定 量聚合酶 鏈 反 應(yīng) 檢測乳腺 癌外周血微小轉(zhuǎn)移[J].中華普通外科雜志,2002,17(1):38.

[3]韓正祥,張敬川.hMAM mRNA和CEA mRNA RT-PCR檢測乳腺癌外周血微轉(zhuǎn)移[J].腫瘤,2004,24(3):273.

R737.9

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：1671-8194（2013）10-0082-02

四川省衛(wèi)生廳面上項(xiàng)目（090119）

*通訊作者：E-mail： lyhqlin@163.com