陳建歡* 鄭玉倩 許慈燕

汕頭大學(xué)·香港中文大學(xué)聯(lián)合汕頭國(guó)際眼科中心，廣東 汕頭515000

老年性白內(nèi)障患者術(shù)前C反應(yīng)蛋白血漿水平與其單核苷酸多態(tài)性的相關(guān)性

陳建歡* 鄭玉倩 許慈燕

汕頭大學(xué)·香港中文大學(xué)聯(lián)合汕頭國(guó)際眼科中心，廣東 汕頭515000

目的 C反應(yīng)蛋白（CRP），作為一種急性期蛋白，參與多種重要的炎癥反應(yīng)。CRP血漿水平在年齡相關(guān)性黃斑變性患者中升高，并可能受遺傳因素調(diào)控，但目前在中國(guó)人群中尚未有相關(guān)研究發(fā)表。本實(shí)驗(yàn)希望通過(guò)研究CRP血漿水平與其單核苷酸多態(tài)性（SNP）的相關(guān)性，分析遺傳因素對(duì)蛋白表達(dá)的影響。方法 我們收集了71例白內(nèi)障患者術(shù)前血樣，對(duì)所有樣本取血漿，并提取基因組DNA。采用Taqman Assay方法對(duì)CRP基因的3個(gè)標(biāo)簽SNP rs1800947、rs1417938和rs1205進(jìn)行基因型測(cè)定。基因型數(shù)據(jù)用Haploview 4.2版本分析Hardy-Weinberg平衡，并對(duì)得到的蛋白及基因型數(shù)據(jù)按加性模型進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析，同時(shí)對(duì)性別和年齡進(jìn)行校正。結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)分析的3個(gè)標(biāo)簽SNP均沒(méi)有偏離Hardy-Weinberg平衡。加性模型分析的結(jié)果顯示，rs1800947的C等位基因與較低的血漿CRP水平顯著相關(guān)。在其他2個(gè)標(biāo)簽SNP中未發(fā)現(xiàn)與血漿CRP水平存在顯著相關(guān)性（P＞0.05）。結(jié)論 本研究首次在中國(guó)人群中證明了CRP血漿水平與其遺傳多態(tài)性存在顯著相關(guān)性，提示CRP的表達(dá)受遺傳調(diào)控，為進(jìn)一步研究其參與炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制提供了參考。

C反應(yīng)蛋白；數(shù)量性狀；關(guān)聯(lián)分析；單核苷酸多態(tài)性

C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein， CRP），一種急性期蛋白，是先天性免疫的重要組成部分，可能參與多種免疫相關(guān)疾病的分子發(fā)病機(jī)制[1]。在眼科疾病研究中，越來(lái)越多的證據(jù)證明炎癥及免疫相關(guān)過(guò)程在年齡相關(guān)性黃斑變性（AMD）中起重要的作用。CRP能與CFH結(jié)合，是其重要的調(diào)控因子，對(duì)白人和日本人群的研究報(bào)告表明，CRP血漿水平在息肉樣脈絡(luò)膜血管病變（PCV）和AMD患者中升高，提示CRP可能參與PCV和AMD的發(fā)病過(guò)程[2-6]。這些都提示，CRP的表達(dá)調(diào)控可能參與AMD的發(fā)病過(guò)程。近期有研究報(bào)導(dǎo)，CRP血漿水平與其基因的多態(tài)性存在顯著關(guān)聯(lián)，提示其并可能受遺傳因素的調(diào)控[7]。但到目前為止，上述這些研究都是在國(guó)外人群中進(jìn)行的，而AMD在不同人群中已知存在較大的遺傳差異[8]，對(duì)于中國(guó)人群CRP血漿水平與其基因的多態(tài)性是否也存在關(guān)聯(lián)，尚未有相關(guān)研究報(bào)導(dǎo)，有待闡明。

本研究希望通過(guò)研究CRP蛋白血漿水平與其單核苷酸多態(tài)性（SNP）的相關(guān)性，分析遺傳因素對(duì)蛋白表達(dá)的影響。

1 方法與材料

1.1 樣本及信息采集

本研究經(jīng)過(guò)汕頭大學(xué) 香港中文大學(xué)聯(lián)合汕頭國(guó)際眼科中心倫理委員會(huì)，并遵循赫爾辛基宣言進(jìn)行。對(duì)每個(gè)參加者都詳細(xì)解釋研究的性質(zhì)并取得其書(shū)面知情同意書(shū)。

本研究入組對(duì)象為71例住院擬進(jìn)行老年性白內(nèi)障手術(shù)的患者，經(jīng)詳細(xì)的眼科檢查，并排除外傷等情況，術(shù)前采集外周血，分離血漿。對(duì)所有樣本取血漿，并提取基因組DNA。基因組DNA和血漿分離提取后隨即存儲(chǔ)于-80C超低溫冰箱，至定量實(shí)驗(yàn)前才取出，以保證質(zhì)量的穩(wěn)定性。

1.2 測(cè)定血漿中的CRP水平

血漿中的CRP水平在Biotek Powerwave XS分光光度計(jì)上用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（人CRP ELISA試劑盒，西唐生物科技，上海）按生產(chǎn)商說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定，并用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法進(jìn)行絕對(duì)定量。

1.3 基因分型

根據(jù)HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)中中國(guó)人的單核苷酸多態(tài)性（SNP）數(shù)據(jù)，在Haploview中按r2＞0.8，次要等位基因頻率≥5%的參數(shù)計(jì)算選取得到CRP的標(biāo)簽SNP，用于代表該基因組區(qū)域內(nèi)的SNP。在LightCycler 480I（Roche， 美國(guó)）型實(shí)時(shí)定量PCR儀上，采用Taqman 探針?lè)▽?duì)CRP基因的3個(gè)標(biāo)簽SNP rs1800947、rs1417938和rs1205進(jìn)行基因型測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

基因型數(shù)據(jù)用Haploview 4.2版本分析Hardy-Weinberg平衡，并對(duì)得到的蛋白及基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)量性狀關(guān)聯(lián)分析，分析按加性模型進(jìn)行線(xiàn)性回歸，同時(shí)對(duì)性別和年齡進(jìn)行校正。

2 結(jié) 果

2.1 Hardy-Weinberg平衡

本實(shí)驗(yàn)分析的3個(gè)標(biāo)簽SNP均沒(méi)有偏離Hardy-Weinberg平衡（HWE P＞0.05）。

2.2 血漿CRP水平

測(cè)得的老年白內(nèi)障患者術(shù)前的CRP血漿水平范圍為153～8392 ng/ mL，平均值±標(biāo)準(zhǔn)差為3187± 2119 ng/mL，并且線(xiàn)性回歸顯示與年齡呈顯著正相關(guān)（效應(yīng)值β ± 標(biāo)準(zhǔn)誤差SE = 34 ± 14 ng/mL年，P = 0.016）。

2.3 SNP與血漿CRP水平的關(guān)聯(lián)分析

加性模型分析的結(jié)果顯示，rs1800947的C等位基因與較低的血漿CRP水平顯著相關(guān)。在其他2個(gè)標(biāo)簽SNP中未發(fā)現(xiàn)與血漿CRP水平存在顯著相關(guān)性（P ＞ 0.05）。對(duì)rs1800947不同基因型的血漿CRP水平進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，帶有GG基因型人的血漿CRP水平為3414 ng/mL，帶CG基因型的為2420 ng/mL，帶CC基因型的為1756.4 ng/mL，隨C等位基因的數(shù)量增加顯現(xiàn)遞減趨勢(shì)（圖1）。

圖1 不同rs1800947基因型中的血漿CRP水平

3 討 論

本研究首次在中國(guó)人群中證明了CRP血漿水平與其遺傳多態(tài)性存在顯著相關(guān)性，提示CRP的表達(dá)受明顯的遺傳調(diào)控，并且加性模型能較好地解釋rs1800947不同等位基因?qū)RP血漿水平的影響。

CRP的血漿水平與年齡密切相關(guān)。Hutchinson等對(duì)德國(guó)和蘇格蘭的白人成年人群的研究表明，55～74歲人群的CRP血漿水平平均為1.50-2.40mg/L，老齡人群中的CRP水平約為年青人群的2倍[9]。我們的研究對(duì)象均為老齡人，結(jié)果與Hutchinson的老齡人群的結(jié)果相比，CRP血漿水平較高，但是一樣檢測(cè)到了CRP與年齡的顯著正相關(guān)關(guān)系。

SNP rs1800947的C等位基因在白人中有報(bào)導(dǎo)與與較低的血漿CRP水平相關(guān)。在我們的中國(guó)人樣本中，rs1800947的C等位基因與較低的血漿CRP水平相關(guān)，這與已有的在國(guó)外人群中的報(bào)導(dǎo)是相一致的，提示CRP表達(dá)水平的遺傳關(guān)聯(lián)具有跨人群的特點(diǎn)。rs1800947位于CRP基因的啟動(dòng)子區(qū)，C等位基因可能通過(guò)改變轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合能力從而影響CRP mRNA的轉(zhuǎn)錄起始效率，進(jìn)而影響CRP的表達(dá)。

CRP是炎癥反應(yīng)的一個(gè)重要指標(biāo)，與多種炎癥及免疫過(guò)程和疾病相關(guān)，在心血管疾病起重要的作用[7]，在眼科疾病中特別與AMD和PCV的發(fā)生有密切關(guān)系[10]。因此，rs1800947可能通過(guò)調(diào)控CRP表達(dá)從而參與AMD和/或PCV的發(fā)生，這將有待進(jìn)一步的研究。

我們的實(shí)驗(yàn)首次在中國(guó)人群中對(duì)CRP的血漿水平與其遺傳多態(tài)性之間的關(guān)系進(jìn)行了研究。結(jié)果證明CRP的血漿水平與其遺傳多態(tài)性之間存在顯著關(guān)聯(lián)。上述發(fā)現(xiàn)需要進(jìn)一步在更多的地區(qū)和人群中對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

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R776.1

B

1671-8194（2013）19-0094-02

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81000397），廣東省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（2010B031600130）

*通訊作者：