李家富,張 濤,陸勤勤,朱建一,沈宗根,劉兆普,王長海

(1.南京農業(yè)大學 資源與環(huán)境科學學院,江蘇 南京 210095;2.常熟理工學院 應用技術研究院,江蘇 常熟 215500;3.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所,江蘇 南通 226007)

壇紫菜(Porphyra haitanensis)是我國特有的暖溫帶物種,也是我國東南沿海廣泛栽培的重要經(jīng)濟紅藻。壇紫菜藻體由殼孢子萌發(fā)生長而成,藻體屬單倍體,具配子體性質。壇紫菜藻體營養(yǎng)細胞生長分布均勻,有性生殖器官分為果胞和精子囊器,一般由藻體的末梢邊緣部分營養(yǎng)細胞轉化而來,精子囊器細胞在形成時,顏色逐漸淡化呈現(xiàn)白色或黃白色;果胞及受精分裂形成的果孢子囊中細胞顏色較營養(yǎng)細胞深,呈深紫紅色[1]。紫菜葉狀體生長在潮間帶,前人對葉狀體營養(yǎng)細胞和生殖細胞的生長特性進行了研究[2-3],對生殖細胞的生理特征主要是對條斑紫菜和半葉紫菜進行了研究[4]。

葉綠素熒光技術在研究PSII對光能的吸收、分配、耗散等方面具有獨特優(yōu)勢,能夠快速、準確、無損傷地檢測植物光合電子傳遞能力等“內在性”特征,是光合作用尤其是 PSII功能研究的天然探針[5]。調制熒光技術首先應用在高等植物PSII原初反應和猝滅分析中,是研究光合生理特性的重要方法[6-7],在大型藻類中的應用則較晚,但已有研究表明該技術也能客觀反映藻類光合特性[8-13]。

本文以壇紫菜葉狀體為材料,對不同生殖細胞及營養(yǎng)細胞葉綠素熒光特性進行了研究,以求進一步了解紫菜葉狀體發(fā)育過程中的光合特性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

用于測試的壇紫菜(圖 1)于 11月采自江蘇省南通紫菜栽培海區(qū),2 h內帶回實驗室,挑選健康完整藻體進行預培養(yǎng),海水暗沉淀,培養(yǎng)溫度為 15℃,光照強度為50 μmol/(m2·s)。預培養(yǎng)1 d后進行葉綠素熒光等指標的測定,實驗進行3次重復測定,測定區(qū)域如圖1序號標示。

1.2 試驗方法

1.2.1 實際量子效率的測定

圖1 壇紫菜Fig.1 Porphyra haitanensis

樣品 PSII實際量子效率采用 Water-PAM(Walz,Effeltrich,Germany)進行測定。將探頭垂直對準藻體不同生殖細胞或營養(yǎng)細胞部位,首先利用0.3 μmol /(m2·s)調制紅光和 64 μmol /(m2·s)光化光,測得該光照條件下熒光值(Ft);隨后提供 0.8 s約4 000 μmol /(m2·s)飽和脈沖光,測得此光化光條件下最大熒光值(Fm′)。按以下公式計算 PSII實際量子效率(ΔF/Fm′):

1.2.2 快速光曲線的測定

對樣品依次提供0至1 020 μmol /(m2·s)共8個光強梯度,待不同光強下熒光值(Ft)達到穩(wěn)定后(約20 s),提供 0.8 s約 4 000 μmol /(m2·s)的飽和脈沖光以測得該光強下最大熒光(Fm′),按以下公式計算相對電子傳遞速率(rETR):

式中,I表示光照強度;A表示樣品的吸光系數(shù),本文中設定為0.85;0.5表示光能由兩個光系統(tǒng)平均分配。

以光照強度作為X軸,rETR為Y軸制作曲線即快速光曲線。參照 Platt等的方法,對快速光曲線進行擬合,分別獲得初始斜率、最大相對電子傳遞速率、半飽和光強等參數(shù):

式中,P表示給定光強下的相對電子傳遞速率(rETR);α表示快速光曲線初始斜率;Pm表示最大相對電子傳遞速率(rETRmax)。

按以下公式計算半飽和光強(Ik):

1.2.3 qP和NPQ的測定

樣品暗適應20 min后,經(jīng)遠紅光照射20 s,然后打開測量光,測得最小熒光值(Fo);然后提供0.8 s飽和脈沖光,測定最大熒光值(Fm);隨后關閉光源,40 s后打開活化光(64 μmol /(m2?s)),之后每隔 20 s照射一次飽和脈沖光,直至該活化光下最大熒光值(Fm′)達到穩(wěn)定。由以下公式計算光化學猝滅(qP)和非光化學猝滅(NPQ):

1.3 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用 t-檢驗分析,顯著水平設為P＜0.05。

2 實驗結果

2.1 營養(yǎng)細胞與生殖細胞實際量子效率差異

在給定的光強下,壇紫菜雌雄藻體營養(yǎng)細胞的△F/Fm′值非常接近,均維持在0.45左右(圖2)。雌藻體營養(yǎng)細胞與雌性生殖細胞的△F/Fm′值無顯著差異,但雄藻體營養(yǎng)細胞△F/Fm′值顯著高于雄性生殖細胞(P＜0.05)。雌、雄生殖細胞間△F/Fm′值存在差異,雌性生殖細胞△F/Fm′值顯著高于雄性生殖細胞(P＜0.05)。

2.2 營養(yǎng)細胞與生殖細胞快速光曲線比較

快速光曲線(RLC)的測定結果表明,隨著光照強度的提高,樣品相對電子傳遞速率(rETR)逐步上升,隨后達到一個相對平穩(wěn)的階段(圖3)。雌、雄藻體營養(yǎng)細胞的 RLC沒有明顯差異,rETR在光照強度為400 μmol /(m2·s)左右均達到穩(wěn)定階段,并維持在11至 15之間。雌性生殖細胞與營養(yǎng)細胞RLC存在一定差異,營養(yǎng)細胞的rETR略高于生殖細胞,但差異不顯著。雄藻體營養(yǎng)細胞的rETR明顯高于雄性生殖細胞,當光強超過 200 μmol /(m2·s),營養(yǎng)細胞的rETR顯著高于雄性生殖細胞(P＜0.05)。由生殖細胞RLC的比較可知,雌性生殖細胞RLC略高于雄性生殖細胞,但差異不顯著。

圖2 營養(yǎng)細胞與生殖細胞實際量子效率比較Fig.2 Compare of yield between vegetative and germ cells of P.haitanensis

圖3 營養(yǎng)細胞與生殖細胞快速光照曲線比較Fig.3 Compare of rapid light curves between vegetative and germ cells of P.haitanensis

通過對RLC擬合,獲得了初始斜率(α)、相對最大電子傳遞速率(rETRmax)和半飽和光強(Ik)等能夠反映樣品光合作用實際狀態(tài)的重要參數(shù)。從表1可見,雌藻體營養(yǎng)細胞與生殖細胞 α、rETRmax和 Ik等參數(shù)比較均無顯著差異;雄藻體營養(yǎng)細胞 α和rETRmax均顯著高于雄性生殖細胞(P＜0.05),Ik無顯著差異;雌性生殖細胞 α顯著高于雄性生殖細胞(P＜0.05),但rETRmax和Ik無顯著差異。

2.3 營養(yǎng)細胞與生殖細胞qP和NPQ比較

誘導曲線的測定是通過對樣品反應中心吸收的光能分配進行測定分析,計算光化學猝滅(qP)和非光化學猝滅(NPQ或 qN)[14]。qP反映 PSII原初電子受體QA的還原狀態(tài),qP值越大則PSII電子傳遞活性越高[15]?？紤]到測定的簡便性,本試驗使用NPQ作為反映非光化學猝滅的指標。從表 2可見,在 64 μmol /(m2?s)活化光條件下,雌藻體營養(yǎng)細胞與雌性生殖細胞 rETR、qP和NPQ均無顯著差異,但雌藻體營養(yǎng)細胞、雌性生殖細胞和雄藻體營養(yǎng)細胞rETR和qP均顯著高于雄性生殖細胞,NPQ則無顯著差異。

3 討論

葉綠素熒光技術在植物光合生理研究中已有廣泛的應用,能夠客觀反映光合生物自身的光合特性及環(huán)境適應能力[16-18]。通過葉綠素熒光測定方法中的快速光曲線(RLC)和誘導曲線的測定,可從多個角度研究樣品對光能的利用能力及對吸收光能的分配特征。本研究表明,壇紫菜雌、雄藻體營養(yǎng)細胞葉綠素熒光參數(shù)間均無顯著差異,說明無論是雌藻體還是雄藻體,其營養(yǎng)細胞的光能實際利用效率、光合電子傳遞能力及對光強的適應能力等較為一致。

表1 營養(yǎng)細胞與生殖細胞快速光曲線參數(shù)比較Tab.1 Compare of rapid light curve parameters between vegetative and germ cells of P.haitanensis

表2 營養(yǎng)細胞與生殖細胞qP和NPQ比較Tab.2 Compare of induction curve parameters between vegetative and germ cells of P.haitanensis

盡管雌性生殖細胞結構形態(tài)和藻體顏色上與營養(yǎng)細胞存在差異,我們的試驗結果表明二者的葉綠素熒光特征并無明顯不同,雌藻體營養(yǎng)細胞ΔF/Fm′和α、rETRmax和Ik等參數(shù)僅略高于雌性生殖細胞,但差別并沒有達到顯著水平,雄藻體營養(yǎng)細胞與雌性生殖細胞的光合熒光參數(shù)同樣差異不顯著,這說明雌性生殖細胞與雌、雄藻體營養(yǎng)細胞光能利用能力相似。

光合色素的含量與細胞光合活性密切相關,光合色素含量較高通常會使得細胞光能利用能力提高[19-21],這種聯(lián)系可能也是導致雄性生殖細胞葉綠素熒光參數(shù)與營養(yǎng)細胞間顯著差異的重要原因,雄性生殖細胞對光能的利用能力明顯低于營養(yǎng)細胞,且在給定光照條件下,雄性生殖細胞的實際量子效率也低于營養(yǎng)細胞。雄性生殖細胞rETRmax顯著低于營養(yǎng)細胞,而 Ik沒有明顯區(qū)別,這說明在給定光照條件下,雄性生殖細胞相對電子傳遞速率較營養(yǎng)細胞低,但二者對光照強度的適應能力相似。上述結果與光合色素含量的研究相一致,即雄性生殖細胞色素較營養(yǎng)細胞和雌性生殖細胞明顯淺淡,稍帶黃、白色,這種顏色的差異是因為細胞間光合色素含量和比例的不同所引起的[22]。誘導曲線的測定結果表明,在給定活化光條件下,營養(yǎng)細胞rETR和qP均顯著高于雄性生殖細胞,即雄性生殖細胞電子傳遞速率和光化學猝滅均處較低水平,其吸收的光能用于光合電子傳遞部分明顯低于營養(yǎng)細胞。雄性生殖細胞NPQ與營養(yǎng)細胞相似,該參數(shù)與光適應能力相關。結合ΔF/Fm′、RLC和誘導曲線的測定結果,推知在不同光照強度下,雄性生殖細胞所吸收的光能用于光合電子傳遞所占比例明顯低于營養(yǎng)細胞,而用于熱耗散的比例明顯高于營養(yǎng)細胞,雄性生殖細胞的這種高熱耗散比例可能是其光適應能力與營養(yǎng)細胞相似的主要原因,通過提高將吸收的光能以熱耗散的形式消耗,從而適應環(huán)境光照強度。

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