韓 燾, 姜敬哲, 王江勇

(1.中國水產(chǎn)科學研究院 南海水產(chǎn)研究所, 廣東 廣州510300; 2.上海海洋大學 水產(chǎn)與生命科學學院, 上海201306)

雜色鮑(Haliotisdiversicolor), 肉質鮮美、營養(yǎng)豐富, 是我國南方重要的鮑養(yǎng)殖品種, 是中華民族的傳統(tǒng)珍饈佳肴。近年來養(yǎng)殖環(huán)境日益惡化, 鮑病害呈現(xiàn)爆發(fā)性的增長趨勢, 對鮑養(yǎng)殖業(yè)造成了極大損 害[1-2]。然而, 從分子水平上對其先天免疫系統(tǒng)以及免疫因子的研究還十分有限, 客觀上限制了鮑病害防控技術的發(fā)展[3]。

雙向電泳(Two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)是1975年建立的[4], 現(xiàn)廣泛應用于醫(yī)學診斷、藥物篩選[5]、毒性機理[6-7]、免疫機制[8]和水產(chǎn)動物的生理調控機制[9]等研究。

雙向電泳技術作為蛋白質組學研究的重要技術, 可以從整體、動態(tài)水平上大規(guī)模、高通量地對總蛋白的分子組成和相互作用規(guī)律進行研究, 定量觀察病害發(fā)生過程中蛋白質種類和數(shù)量的變化, 能更直接地了解致病機理和免疫機制, 為病害防治提供依據(jù)[10-11]。但雙向電泳對研究者技術要求較高, 不同研究材料需要建立不同的雙向電泳體系。目前針對海洋無脊椎動物已經(jīng)建立的雙向電泳體系包括: 西施舌(Coelomactra antiquata)的外套膜[12]、紫貽貝(Mytilus galloprovincialis)的消化腺[5]、泥蚶(Tegillarca granosa)的肌肉[13]、藍斑背肛海兔(Notarchus leachii cirrosusStimpson)和褐云瑪瑙螺(Achatina fulica(Ferussae))的大腦神經(jīng)節(jié)(cerebral ganglion,CG)[6]、縊蟶(Sinonovacula constricta)[14]和牡蠣(Bonamia ostreae)[8]的血淋巴、南美白對蝦(Penaeus vannamei)的血細胞[15]、中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)的血漿[16]以及雜色鮑的肝胰腺[7]等。

本文首次以雜色鮑血淋巴總蛋白為研究對象, 成功建立了雙向電泳技術平臺。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

雜交鮑(遺傳背景不祥)購自廣州下渡市場, 平均質量(30±5)g; 其他試驗均使用購自汕尾市粵順海珍品養(yǎng)殖有限公司的雜色鮑, 平均質量為(20±5)g, 暫養(yǎng)于水溫15~18.5℃、鹽度30、50 cm×30 cm×40 cm玻璃缸(帶循環(huán)水和泵氧設備)中。

1.2 試劑與儀器

固相pH梯度干膠條IPG strip非線性(pH 3-10, 18 cm)、兩性電解質IPG buffer(pH 3-10)和Drystrip Cover Fluid等購自美國GE Healthcare公司; 丙磺酸(CHAPS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、四甲基乙二胺(TEMED)、尿素(Urea)、硫脲(Thiourea)、二硫蘇糖醇(DTT)和碘乙酰胺(IAA)等購自美國Sigma公司; 乙醇、冰醋酸、Na2S2O3等均為國產(chǎn)分析純; 蛋白標準2-D Protein MW Marker購自TaKaRa公司; 蛋白酶抑制劑 Protease &Phosphatease Inhibitor Single-Use Cocktail, EDTA-free(100×)購自美國Thermo公司; 蛋白定量試劑盒(RC DC Protein Assay)購自美國Bio-Rad公司; BCA、Bradford蛋白定量試劑盒購自香港昊柏生物公司, Lowry改良試劑盒購自美國andybio公司。

等電聚焦儀EttanIPGphor 3、ImageScanner掃描儀、ImageMaster 2D Platinum 7.0圖像分析軟件等購自美國GE Healthcare公司; 垂直電泳Protean Ⅱ XL系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司; 凍干機為美國Virtis公司Advantage桌上型冷凍干燥機; 純水系統(tǒng)(ELGA PURELAB CLASSIC)購自英國ELGA公司。

1.3 蛋白樣品的制備與定量

1.3.1 血淋巴樣品的制備

血細胞和血漿的分離: 用解剖刀劃開鮑腹足表面, 取血淋巴于離心管中, 500 r/min, 4℃離心5 min, 上清即為血漿, 沉淀為血細胞, 沉淀留在離心管中; 大分子血藍蛋白的去除: 35 000 r/min, 4℃, 2 h, 棄沉淀, 取上清。

1.3.2 血淋巴和血漿總蛋白的提取

取血淋巴或血漿5 mL, 加入4倍體積的預冷丙酮, 攪拌均勻后–20℃沉淀過夜; 12 000 r/min, 4℃, 離心15 min, 棄上清; 重懸沉淀于預冷丙酮, –20℃沉淀3 h; 12 000 r/min, 4℃, 離心15 min, 棄上清; 重復前兩個步驟1次; 加入少量預冷丙酮, 將混合均勻的蛋白丙酮液分裝入1.5 mL離心管中, 每管0.2 mL; 12 000 r/min, 4℃, 離心15 min, 棄上清液; 用真空濃縮機抽干剩余丙酮, 直到樣品完全干燥; 將制備好的蛋白丙酮干粉置于–80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 蛋白的溶解與定量

取血淋巴或血漿總蛋白的丙酮干粉, 或取血細胞沉淀, 按1∶10(W∶V)加入裂解液(7 mol/LUrea、2 mol/LThiourea、2% CHAPS、40 mmol/L DTT和0.5 % IPG Buffer), 振蕩溶解, 冰上超聲促融, 功率80 W, 周期0.5, 60次。12 000 r/min, 4℃離心30 min, 取上清即為蛋白樣品。使用RC DC Protein Assay進行蛋白定量。

1.4 雙向電泳

1.4.1 等電聚焦電泳

使用18 cm pH 3-10 IPG非線性膠條, 總蛋白量80~150 μg, 上樣體積340 μL(血淋巴上樣量150 μg時加入5 μL 2-D Protein MW Marker), 被動水化上樣16 h。

參照IPGphor等電聚焦指南設置程序: 500 V 1 h、1 000 V 1 h、8 000 V 3 h、8 000 V 2 h、500 V保持。每根膠條電流50 μA, 溫度20℃。

1.4.2 膠條平衡

采用兩步平衡法, 每步15 min, 平衡液為6 mol/L urea, 2% SDS, 75 mmol/L Tris-HCl, 20%甘油, 1% DTT, 體積10 mL, 第二步平衡時用2.5% IAA代替DTT。

1.4.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

SDS-PAGE電泳膠濃度為12%。將平衡后的IPG膠條轉移至SDS凝膠上端, 用0.5%瓊脂糖溶液封頂。電泳參數(shù)設置: 50~100 V, 直至溴酚藍指示劑到達底部邊緣時電泳結束。

1.5 凝膠染色、掃描及圖像分析

1.5.1 銀染(每塊凝膠使用250 mL的溶液體系)

固定 30 min(乙醇100 mL, 冰醋酸25 mL, 用超純水定容至250 mL); 敏化 30 min(乙醇75 mL, Na2S2O30.5 g, NaAc17 g, 定容至250 mL); 漂洗 5 min×3(250 mL); 銀染 20 min(AgNO30.625 g, 定容至 250 mL); 漂洗 1min×2(250 mL); 顯色 5~10 min(Na2CO36.25 g, 甲醛0.1 mL(使用前加入), 定容至250 mL; 此步通過肉眼觀察確定具體時間); 終止 10 min(EDTA-2Na 4.165 g, 冰醋酸25 mL, 定容至250 mL); 漂洗5 min×3(250 mL)。

1.5.2 凝膠掃描及圖像分析

凝膠用 ImageScanner掃描儀掃描, 并用ImageMaster 2D Platinum 7.0圖像分析軟件對掃描圖譜處理分析。

1.6 質譜分析

為檢驗雙向電泳凝膠與質譜的兼容性, 同時也為建立蛋白樣品本身蛋白標記以防止蛋白Marker對其他蛋白點的影響, 選取4個蛋白點, 切割后置于1.5 mL 離心管中, 送至暨南大學生命與健康工程研究院使用ABI 4800 plus MALDI-TOF/TOF質譜儀進行質譜分析。

2 結果

2.1 樣品制備與蛋白定量方法的選擇

樣品制備先后嘗試了3種方法: 直接裂解液處理、凍干法和丙酮沉淀法。直接裂解液處理是將血漿與裂解液按比例直接混合, 混合后出現(xiàn)大量沉淀。凍干法制備的血漿干粉可以較好地溶于裂解液, 但蛋白定量時加入的BCA和Bradford等試劑會產(chǎn)生大量沉淀, 干擾定量。改用丙酮沉淀法提取的蛋白干粉與幾種蛋白定量試劑兼容良好, 無沉淀, 可準確定量。但當丙酮沉淀的蛋白干粉溶于裂解液后, 裂解液成分與部分定量試劑不能很好兼容: 如使用改良Lowry法測得的線性R2值只有0.3072, Bradford法的為0.9332, RC DC法的最高, 為0.9941(圖1)。后續(xù)蛋白定量均使用RC DC法。

圖1 RC DC蛋白定量標準曲線 Fig. 1 Standard curve of RC DC protein quantitative

2.2 不同血淋巴組分的比較

實驗中比較了雜交鮑的兩種血淋巴組分樣品(血漿和血細胞)的電泳結果, 如圖2所示。兩個樣品蛋白組成差異明顯, 血漿樣品(即去除血細胞后的血淋巴)的蛋白點較多, 分離效果良好, 而血細胞樣品的蛋白點較少, 中間偏上位置的蛋白點分離效果有限, 多成串狀分布, 可能為經(jīng)過復雜修飾后的膜蛋白。

2.3 血藍蛋白的去除

實驗發(fā)現(xiàn), 在電泳凝膠上端有大量高分子質量蛋白, 多為血藍蛋白[16-18]。本研究通過超速離心去除了多數(shù)的高分子質量血藍蛋白, 如圖3所示。經(jīng)過超速離心后, 凝膠頂端聚集的蛋白明顯減少, 其他分子質量蛋白變化不明顯。

圖2 雜交鮑2種不同血淋巴組分的雙向電泳圖 Fig. 2 2-DE maps of two different hemolymph components of hybrid abalone

圖3 超離前后雙向電泳凝膠上端比較 Fig. 3 Comparison top parts of 2D-PAGE maps before and after ultracentrifugation

2.4 不同上樣量的電泳效果

實驗中比較了3種上樣量的電泳效果, 如圖4所示。3次實驗的重復性較好。上樣量80 μg時, 凝膠中間偏上部份的分離效果最好, 但總蛋白點數(shù)較少, 只有234個; 上樣120 μg時, 凝膠中上部的背景加深, 點數(shù)增多至264個; 上樣150 μg時, 點數(shù)增多不明顯(276個), 凝膠中上部背景較高, 但其他區(qū)域低豐度蛋白點信號有所增強。

2.5 質譜鑒定

所選4個蛋白點二級質譜結果: 1為肌動蛋白, 2為原肌球蛋白, 3為血藍蛋白1型亞基, 4為膠原蛋白, 圖5為所選蛋白點的凝膠位置顯示, 圖6中A-D為蛋白一級質譜圖, 表1為蛋白信息。

4個蛋白點的質譜結果與凝膠圖譜比較, 2號點的理論值與圖中觀測值一致, 1、3、4號點的理論等電點與圖中觀測值有差異, 3、4號點的理論分子質量與圖中觀測值有差異。

圖4 不同上樣量的雜色鮑血淋巴總蛋白2-DE圖譜(銀染) Fig. 4 2-DE maps of Haliotisdiversicolor hemolymphtotal protein with different loading amounts (silver staining)

圖5 上樣量150 μg的雜色鮑血淋巴總蛋白2-DE圖譜(銀染) Fig. 5 2-DE maps of Haliotis diversicolor hemolymphtotal protein with 150 μg loading amounts (silverstaining)

3 討論

3.1 研究材料的選擇與前處理

節(jié)肢動物及大多數(shù)的軟體動物都為開放式循環(huán)系統(tǒng), 它們的血淋巴(體液)從心臟流出后被直接輸送到體內各組織中, 在它們回到心臟之前, 會與機體的多數(shù)組織液充分混合并產(chǎn)生交換。因此, 這些動物的血淋巴組成非常復雜, 攜帶各種功能蛋白、小分子多肽以及生化代謝物, 機體的任何一種生理變化都可能在血淋巴成分變化中反應出來[19-20]。例如: 對縊蟶血淋巴蛋白組的研究發(fā)現(xiàn), 高溫應激下血淋巴中多種蛋白發(fā)生了變化, 最終鑒定出鋅指蛋白和chelonianin蛋白[14]; 對牡蠣血淋巴蛋白的合成、誘導、上調和下調的研究將有助于理解免疫機制和抑制病害感染[8]。

本研究以腹足綱的鮑為材料, 其肌肉裸露, 只需劃開腹足即可方便地采集血淋巴樣品?？紤]到血淋巴組分過于復雜, 為了降低背景、簡化問題, 研究中還對鮑血淋巴樣品進行了分級處理。首先, 通過低速離心有效分開了血細胞與血漿組分(圖2), 減少了血細胞蛋白與血漿蛋白的相互干擾; 其次, 通過超速離心方法[17,21]有效降低了高分子質量血藍蛋白的干擾(圖3), 一定程度上降低了背景, 增加了低豐度蛋白的檢出概率。雖然之前Zhou等[7]以雜色鮑肝胰腺為材料進行了雙向電泳研究, 但以鮑血淋巴為材料的蛋白質組學相關研究尚未見報道。該技術方法的建立不僅為鮑免疫抗病研究提供保障, 還將為鮑機體內營養(yǎng)物質代謝、生長信號調控和物質運輸?shù)确矫娴难芯看蛳铝己没A。

3.2 總蛋白制備及上樣量的選擇

總蛋白的制備與準確的上樣量是影響雙向電泳結果的重要因素。本研究綜合考慮了三種蛋白制備方法。直接裂解液處理和凍干法操作簡單且蛋白損失少, 但由于溶解或定量過程中出現(xiàn)大量纖維蛋白沉淀, 干擾后續(xù)實驗進行, 因此放棄。雖然丙酮沉淀法步驟繁瑣, 過程中會損失一些蛋白, 但為保證實 驗的重復性和電泳效果, 最終以獲得蛋白純度最高、定量最準確的丙酮沉淀法作為總蛋白制備方法。實踐證明, 該方法所得蛋白點總數(shù)依然達到了276(圖4), 能夠滿足研究需要。

圖6 4個蛋白點的MALDI-TOF/MS 肽質量指紋圖譜 Fig. 6 MALDI-TOF/MS peptide mass fingerprint (PMF) spectra in geltryptic digest of four protein spots

表1 4個蛋白點的質譜鑒定結果 Table. 1 The identification results of four protein spots

文中還對3種不同上樣量血淋巴總蛋白進行了比較。發(fā)現(xiàn)上樣120 μg時圖像最清晰, 背景較淺, 適合圖像分析及高豐度蛋白點的鑒定; 而150 μg的背景相對較深, 不適用于圖像分析, 但有利于低分子質量蛋白的研究。由此可知, 上樣量的選擇應該依研究需要而定, 不同的血淋巴組分還需依實際情況而定。

3.3 質譜分析與蛋白鑒定

一些低豐度蛋白可能具有很重要的功能, 而考染的分辨率較低, 因此, 本實驗凝膠染色方法使用銀染。但是傳統(tǒng)銀染與目前的MALDI-TOF/TOF質譜技術不兼容, 預實驗使用傳統(tǒng)銀染時選取3個蛋白點均未鑒定成功, 后續(xù)實驗對銀染方法進行改進, 在敏化液中不加戊二醛、銀染液中不加甲醛, 蛋白點數(shù)(276)能滿足實驗需要, 之后選取4個蛋白點均鑒定成功, 說明兼容性好, 改進的銀染方法可行。

蛋白點的質譜結果與凝膠圖譜比較, 其中2號點的理論值和圖中觀測值基本一致, 且總離子得分值與總離子一致性都很高, 說明該蛋白點與數(shù)據(jù)庫中蛋白完全吻合, 并進一步證明本研究所建立的雙向電泳和質譜方法是可靠的; 1、4號兩個點的總離子得分分別只有10、12, 說明這兩個蛋白與數(shù)據(jù)庫中已知蛋白只有小段序列匹配, 但兩個質譜結果的總離子一致性(即可靠性)均大于95%, 說明結果是可靠的, 進一步考慮到1、4號兩點的等電點或分子質量與數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)并不一致, 說明它們可能是不同于數(shù)據(jù)庫中蛋白的同源或相似蛋白; 3號點的等電點的兩個值有差異而且圖中觀測分子質量遠遠小于理論值, 但是總離子得分值很高, 即匹配肽段較多, 由此可推測該蛋白是血藍蛋白在裂解液中裂解成的片段或者本身分解的功能肽段。

文中所鑒定的肌動蛋白是貝類肌肉中的肌原纖維蛋白的重要組成部分, 是重要的結構蛋白之一, 可影響并調控肌動球蛋白之間的相互作用[13]。原肌球蛋白是細肌絲中與肌動蛋白的結合蛋白, 主要作用是加強和穩(wěn)定肌動蛋白絲, 并在肌肉收縮的調節(jié)中起重要作用[22]。膠原蛋白是細胞外基質中最重要的組成部分, 功能是維持皮膚和組織器官的形態(tài)和結構, 也是修復各損傷組織的重要原料物質[23]。上述三種蛋白均為結構蛋白。血藍蛋白是節(jié)肢動物和軟體動物血淋巴中的一種多功能蛋白, 它在以完整蛋白發(fā)揮功能的同時, 其多樣的降解肽段也在發(fā)揮著重要的生物功能[24-25]。本實驗鑒定的3號蛋白點是血藍蛋白中未見報道的新肽段, 對血藍蛋白的研究具有一定意義。

4 結論

以鮑血淋巴為研究材料, 通過對樣品前處理、總蛋白制備與定量、雙向電泳條件、顯色方法、數(shù)據(jù)處理與分析方法的摸索, 最終成功建立了以雙向電泳為基礎的鮑血漿蛋白質組學研究方法。該方法的建立將為鮑免疫防御機理研究等提供技術保障。

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