浦蘊惠 , 許星鴻, 高 煥, 劉兆普 閻斌倫

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 江蘇省海洋生物學(xué)重點實驗室, 江蘇 南京 210095; 2.淮海工學(xué)院 江蘇省海洋生物技術(shù)重點建設(shè)實驗室, 江蘇 連云港 222005)

脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)又名白蝦、迎春蝦, 隸屬甲殼動物亞門(Crustacea), 軟甲綱(Malacostraca), 真軟甲亞綱(Eumalacostraca), 十足目(Decapoda), 長臂蝦科(Palaemonidae), 為熱溫帶海區(qū)底棲蝦類, 是中國3種重要的經(jīng)濟(jì)蝦類之一, 尤以黃海和渤海產(chǎn)量較多。脊尾白蝦肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、營養(yǎng)豐富, 還可加工制成海米, 故有“金鉤蝦米”之稱, 其卵也可制成蝦籽, 是深受人們喜愛的海味佳肴。近年來, 隨著中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)、日本囊對蝦(Penaeus japonicus)等傳統(tǒng)蝦類養(yǎng)殖難度的加大, 脊尾白蝦養(yǎng)殖面積迅速擴(kuò)大, 成為池塘單養(yǎng)及與其他種類混養(yǎng)的重要品種。目前在脊尾白蝦的行為[1]、鹽度[2-3]、溫度[3]、營養(yǎng)[4-6]、生長[5-6]及育苗生產(chǎn)技術(shù)[7]等方面都已有研究, 但脊尾白蝦精子的體外保存迄今未見報道。在育種上, 精子的體外保存可避免近親交配, 增加遺傳優(yōu)勢, 解決雌、雄不同步成熟等問題, 對脊尾白蝦種質(zhì)優(yōu)選、雌核發(fā)育、建立優(yōu)良種質(zhì)庫有重要意義。作者采用精子存活率與頂體酶活力兩種評價精子質(zhì)量的指標(biāo), 研究了脊尾白蝦精子體外保存中稀釋劑、抗凍劑對保存效果的影響, 試圖尋找脊尾白蝦精子體外保存的最佳條件, 以期為其精子代謝及生理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 脊尾白蝦來源及精子的采集

脊尾白蝦于2011年10月取自連云港贛榆縣養(yǎng)殖場, 挑選雄性個體, 體長(5.90±0.57)cm, 體質(zhì)量(2.76±0.78)g。解剖后, 取出精巢置于研缽中, 加入少量無鈣離子人工海水(海水配方: NaCl 21.63 g, NaOH 0.19 g, KCl 1.12 g, MgSO4·7H2O 4.93 g, H3BO30.53 g, 加蒸餾水定容至1 000 mL), 研磨后, 用200目篩絹網(wǎng)過濾去除組織碎片, 1 000 r/min離心5 min, 取得白色精子沉淀, 4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

Ficoll液: 以 0.12 mol/L NaCl, 0.025 mol N-2羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(Hepes)緩沖液配制11%400型聚蔗糖(Ficoll)溶液, 調(diào)節(jié)pH 至7.5。加入0.1%疊氮鈉延長Ficoll液的保存時間。

去污緩沖液: 以0.055 mol/L NaCl, 0.055 mol/L Hepes 緩沖液配制0.01%Triton X-100溶液, 調(diào)節(jié) pH為8.0, 加入0.1%疊氮鈉以延長保存期。

500 mmol的鹽酸苯甲脒水溶液在冰箱中最長可貯存2 周。

底物: 23 mmol/L Nα-苯甲酰-DL-精氨酸-P-硝?；桨?BAPNA), 使用二甲基亞砜(DMSO)配制, 當(dāng)天使用。

底物和去污劑混合物: 去污劑緩沖液和BAPNA/DMSO底物按9: 1的體積混合。

稀釋劑成分:見表1。

表1 稀釋劑成分 Tab. 1 The composition of diluting solutions

1.3 方法

1.3.1 不同稀釋劑對精子低溫保存的影響

將1.1取得的白色精子沉淀置于離心管中, 分別用7種稀釋劑制備成106個/mL的精子懸浮液, 4℃下保存, 分別于0、1、2、3、4 d測定精子存活率及頂體酶活力。

1.3.2 不同稀釋劑對精子超低溫保存的影響

實驗組設(shè)置與 1.3.1相同, 并每組添加10%DMSO作為抗凍劑, 對照組不加抗凍劑, 且以低溫保存下最佳稀釋劑為對照組的稀釋劑, 分別于0、1、2 d測定精子存活率以及頂體酶活力。

1.3.3 不同抗凍劑對精子超低溫保存的影響

采用上述所篩選出的最適稀釋劑, 以DMSO和甘油作為抗凍劑, 設(shè)置10個組合: 實驗Ⅰ～Ⅳ組分別含甘油(V/ V) 5%、10%、15%、20%; 實驗Ⅴ～Ⅷ組分別含二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO) (V / V) 5%、10%、15%、20%; 實驗Ⅸ組分別含DMSO和甘油各10%; 實驗Ⅹ組分別含DMSO和甘油各20%。

對照組不加抗凍劑, 各組精子與稀釋劑的混合液于冰箱4℃降溫平衡30 min后, 然后將樣品投入液氮中保存。

解凍方法: 打開液氮罐, 取出樣品迅速放入40℃水浴中解凍, 用以檢測各組精子存活率和頂體酶活力。

1.3.4 精子存活率的檢測方法

分別從各實驗組取1滴精子懸液于干凈載玻片上, 涂片, 用2%曙紅B染色液(天然海水配制)染色3～4 min, 顯微鏡觀察, 死精子染成紅色, 活精子不著色或者部分輕微著色。每次隨機(jī)計數(shù)200個精子, 分4個隨機(jī)計數(shù)點, 每個點約計50個精子, 統(tǒng)計精子存活率。

1.3.5 精子頂體酶活力的測定方法

作者參考Kennedy[15]的方法, 并進(jìn)行了適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。

(1) 1.5 mL離心管中加入精子懸液, 每管體積不多于 250μL; (2) 同時做對照實驗, 0.5 m L Ficoll液注入1.5 mL離心管, 精液必須懸在Ficoll上; (3) 室溫條件下, 3 400 r/min離心30 min; (4)去除精漿和 Ficoll 懸浮液, 大約有100μL 的精子沉淀和少量 Ficoll留在管中; (5)加入100μL鹽酸苯甲脒溶液到對照組, 并攪勻; (6)每組試管(包括對照組)各添加 1 mL底物和去污劑混合液, 混勻; (7) 25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵化3 h, 每小時混合一下; (8)孵化3 h后, 添加100 μL鹽酸苯甲脒溶液到所有實驗組(對照組除外); (9) 3 400 r/min離心30 min, 分別收集懸浮溶液; (10)用酶標(biāo)儀在410 nm處測量吸光值; (11)酶活力計算: 頂體酶的國際單位, 可以用在 25℃降解1μmol Nα-苯甲酰-DL-精氨酸-P-硝酰基苯胺(Nα-Benzoyl- DL-arginine-P-nitroanilide hydrochloride, BAPNA) /min來表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

各實驗均重復(fù)3次, 實驗數(shù)據(jù)采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示, 并采用SPSS16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理, 進(jìn)行單因子方差分析(One-way ANOVA), LSD(Least Significant Difference)多重比較、Duncan檢驗。

2 結(jié)果

2.1 不同稀釋劑對精子低溫保存的影響

脊尾白蝦精子在各稀釋劑中保存的時間均為4 d, 不同稀釋劑對低溫保存后精子存活率的影響見表2。精子初始存活率為93.18%, 隨著處理時間延長, 各組精子存活率與頂體酶活力均出現(xiàn)差異。4℃下保存30 min后, 除稀釋劑Ⅱ、稀釋劑Ⅶ外, 其余稀釋劑的精子存活率均在85%以上, 其中稀釋劑Ⅰ的存活率最高, 達(dá)到89.63%, 稀釋劑Ⅶ最低, 為76.86%, 1、2 d后各組存活率持續(xù)下降, 趨勢大體相同, 稀釋劑Ⅰ均為最高, 其次為稀釋劑Ⅴ、Ⅵ, 稀釋劑Ⅶ最低。4 d后稀釋劑Ⅰ下存活率最高, 達(dá)到71.50%。從降幅來看, 以稀釋劑Ⅰ最小, 其次為稀釋劑Ⅴ、Ⅵ, 稀釋劑Ⅶ降幅達(dá)到最大, 高達(dá)41.71%。

表2 不同稀釋劑對低溫保存的脊尾白蝦精子存活率的影響 Tab. 2 Survival rate of spermatozoa of Exopalaemon carinicauda under hypothermic preservation with different diluting solutions

圖1 不同稀釋劑對低溫保存的脊尾白蝦精子頂體酶活力的影響 Fig.1 Acrosin activities of spermatozoa of Exopalaemon carinicauda under hypothermic preservation with different diluting solutions

不同稀釋劑對低溫保存后精子頂體酶活力的影響見圖1, 隨著處理時間延長, 低溫保存后的精子頂體酶活力逐漸下降。4℃平衡30 min后, 稀釋劑Ⅰ保 存下的精子頂體活力最高, 其次為稀釋劑Ⅴ、 , Ⅵ 稀釋劑Ⅶ保存下的精子頂體酶活力最低。低溫保存4 d后, 稀釋劑Ⅰ保存下的活力最高, 為1.803 μIU/106, 對照組最低。

由表2、圖1比較分析得出, 兩種評價精子活力的方法得出的結(jié)果基本一致, 變化趨勢相同, 壬氏液為脊尾白蝦精子低溫保存的最佳稀釋劑, 其次是稀釋劑 , Ⅴ 稀釋劑Ⅶ的保存效果最差。4 d后, 各組稀釋劑精子存活率與頂體酶活力之間相關(guān)性顯著,γ=0.846 (P<0.05)。

2.2 稀釋劑對精子超低溫保存的影響

不同稀釋劑對精子超低溫保存后存活率的影響見表3。精子初始存活率為92.54%, 隨處理時間延長, 各組精子存活率出現(xiàn)差異。4℃平衡后, 除對照組外, 其余各組稀釋劑的精子存活率均在85%以上, 其中稀釋劑Ⅰ的存活率最高, 達(dá)到90.23%, 稀釋劑Ⅶ最低, 為86.53%, 1 d后各組存活率持續(xù)下降, 稀釋劑Ⅰ下的存活率仍為最高。2 d后, 稀釋劑Ⅰ下存活率最高, 達(dá)到83.50%, 對照組最低, 降至55.66%。從降幅來看, 以稀釋劑Ⅰ最小, 其次為稀釋劑Ⅵ、Ⅴ, 稀釋劑Ⅶ降幅達(dá)到最大, 達(dá)18.63%。各組的保存效果均比4℃下的保存效果好。

表3 不同稀釋劑對超低溫保存的脊尾白蝦精子存活率的影響 Tab. 3 Survival rate of spermatozoa of Exopalaemon carinicauda under cryopreservation with different diluting solutions

不同稀釋劑對精子超低溫保存頂體酶活力的影響見圖2, 隨著處理時間延長, 精子的頂體酶活力逐漸下降。4℃平衡30 min后, 稀釋劑Ⅰ保存下的精子頂體活力最高, 為3.760μIU/106, 其次為稀釋劑Ⅴ、Ⅵ, 除對照組外稀釋劑Ⅶ保存下的精子頂體酶活力最低。保存2 d后, 稀釋劑Ⅰ保存下的活力仍然最高, 為2.507μIU/106, 對照組最低, 僅為0.919μIU/106。

圖2 不同稀釋劑對超低溫保存的脊尾白蝦精子頂體酶活力的影響 Fig. 2 Acrosin activities of spermatozoa of Exopalaemon carinicauda under cryopreservation with different dilution solutions

由表3、圖2比較分析得出, 兩種評價精子活力的方法得出的結(jié)果相似, 壬氏液為脊尾白蝦精子超低溫保存的最佳稀釋劑, 稀釋劑Ⅶ的保存效果最差, 且此結(jié)果與4℃下低溫保存的結(jié)果相似。各組稀釋劑精子存活率與頂體酶活力之間相關(guān)性極顯著,γ=0.862 (P<0.01)。

2.3 抗凍劑對精子超低溫保存的影響

不同抗凍劑對精子超低溫保存后精子存活率的影響見表4。精子初始存活率為92.36%, 平衡后各組的存活率均有不同幅度的降低, 對照組下降最明顯。超低溫保存1 d后, 對照組存活率最低, 實驗組Ⅶ的精子存活率最高, 達(dá)到85.11%, 其次為實驗組Ⅵ、Ⅴ。保存2 d后, 精子存活率明顯下降, 但仍是實驗組Ⅶ的存活率最高, 高達(dá)81.32%, 其次為實驗組Ⅵ、Ⅴ, 對照組僅為42.84%。

從表4分析得出, 隨著甘油體積分?jǐn)?shù)的增加, 精子存活率也逐漸增加, 但達(dá)到20%時, 存活率卻有所下降。同樣隨著DMSO的體積分?jǐn)?shù)從5%到15%, 存活率也隨之升高, 15%時達(dá)到最高, 而20%時存活率下降。10%甘油和10%DMSO的實驗組Ⅹ的存活率較其他實驗組都要低。

不同抗凍劑對超低溫保存后精子頂體酶活力的影響結(jié)果見圖3。平衡30 min后, 各組精子頂體酶活力即出現(xiàn)了明顯差異, 實驗組Ⅶ的頂體酶活力最高, 其次是實驗組Ⅲ、Ⅵ。1 d后, 各組頂體酶活力均下降, 實驗組Ⅶ的頂體酶活力在各實驗組中仍然最高, 其次是實驗組Ⅵ、Ⅴ, 對照組精子頂體酶活力最低。2 d后趨勢與1 d后相同, 實驗組Ⅶ的頂體酶活力降為1.385μIU/106。

由表4、圖3比較分析得出, 兩種評價分析精子活力的方法得出結(jié)果大體相同, DMSO比甘油的保存效果好, 且實驗組Ⅶ保存效果在所有實驗組中最好, 其次是實驗組Ⅵ, 對照組兩種指標(biāo)值均最低。各實驗組精子存活率與頂體酶活力之間相關(guān)性極顯著, 相關(guān)系數(shù)γ=0.864(P<0.01)。

表4 不同抗凍劑對低溫保存的脊尾白蝦精子存活率的影響 Tab. 4 Survival rate of spermatozoa of Exopalaemon carinicauda under cryopreservation with different cryoprotectants

圖3 不同抗凍劑對超低溫保存的脊尾白蝦精子頂體酶活力的影響 Fig. 3 Acrosin activities of spermatozoa of Exopalaemon carinicauda under cryopreservation with different cryoprotectants

3 討論

3.1 精子保存質(zhì)量的評價方法

觀察精子運動性是評價無脊椎動物精子活力的方法。十足目甲殼動物精子沒有鞭毛[16], 精子不能運動, 所以運動能力不能用于其精子的評價。這是評價冷凍保存對脊尾白蝦精子活力影響的最大難點所在。已有的精子活力評價方法有生物染色、低滲外吐實驗、精卵相互作用、生化分析及精子頂體反應(yīng)的誘導(dǎo)[17-19]。

本實驗采用染色法和頂體酶活力兩種方法來評價精子體外保存的效果。染色法要是依靠生物體的代謝作用, 將色素迅速排到胞外, 本實驗采用2%曙紅B染色液, 死精子染成紅色, 活精子不著色或者部分輕微著色。精子頂體酶是精子頂體部特有的胰蛋白酶, 在頂體反應(yīng)、精子和卵子透明帶的結(jié)合及穿透中起重要作用。采用頂體酶活力作為指標(biāo)有利于甲殼動物精子冷凍保存的研究。通常在此類研究中較常用的是染色法, 本實驗采用兩種方法來評價, 為驗證頂體酶活力是評價精子活力有效方法提供依據(jù)。染色法的成本低, 但計數(shù)工作量大, 主觀性強(qiáng), 頂體酶活力的測定操作簡便, 實驗結(jié)果更為客觀, 但成本較高。

3.2 稀釋劑對精子保存效果的影響

稀釋的天然或人工海水已被廣泛地用于十足目甲殼動物精子冷凍的研究中[17,19-21]。本實驗參考魚類、蝦類、貝類等精子稀釋方法, 根據(jù)脊尾白蝦生物學(xué)特性篩選出7種稀釋劑, 再根據(jù)預(yù)實驗得出的適宜pH和滲透壓修改而成。Na+、K+、Ca2+、Mg2+是精漿的重要組分, 也是構(gòu)成精漿滲透壓的主要離子。K+、Na+離子在無脊椎動物精子活動中具有重要作 用[22]。適量的K+有延長精子壽命的作用。Ca2+對精子活動的影響與K+、Na+和葡萄糖完全不同, Ca2+濃度過高會對精子活力產(chǎn)生抑制作用[23-24]。

陳東華等[25]研究發(fā)現(xiàn)稀釋劑Ⅴ是中華絨螯蟹精子短期體外保存的理想保存液。本實驗中7種稀釋劑中保存效果以壬氏液(稀釋劑Ⅰ)的效果最佳, 其次為稀釋劑Ⅴ、稀釋劑Ⅵ, 這3組的稀釋劑中都含NaCl、KCl、NaHCO3這3種組分, 但各組含量不同, 可能導(dǎo)致保存效果的差異性。稀釋劑Ⅶ的保存效果最差, 可能是K+的濃度過高, 抑制了精子的活力。哺乳動物和魚類精子保存的研究發(fā)現(xiàn), 適量添加葡萄糖等糖類物質(zhì), 能有效維持低水平的精子代謝, 增強(qiáng)精子活力, 以延長精子壽命[23-24]。但本實驗中添加了葡萄糖的稀釋劑Ⅶ、D-20(稀釋劑Ⅲ)保存效果并不理想, 可能因為脊尾白蝦為十足目甲殼動物, 精子無鞭毛, 不能運動, 對葡萄糖這類能源物質(zhì)的需求不高, 所以添加了葡萄糖對保存效果并沒有幫助。D-20(稀釋劑Ⅲ)的保存效果差的原因可能還因為成分過于單一。

3.3 抗凍保護(hù)劑對精子保存效果的影響

Chow等[26]研究發(fā)現(xiàn)10%的甘油對羅氏沼蝦精莢的冷凍保存效果最佳, 解凍后能成功授精。陳松林等[27]用6%DMSO作為抗凍劑低溫保存鰱、鯉等鯉科魚類的精子時效果最佳低溫保存?？聛喎虻萚20]采用含有10%DMSO和5%～10%甘油的稀釋液冷凍保存中國對蝦的精子, 存活率在60%以上, 解凍后人工授精, 受精率達(dá)到59%。不同甲殼動物的抗凍劑是不一樣的, DMSO、甘油是最常用的兩種抗凍劑。甘油、DMSO通過滲入精子細(xì)胞中, 增加細(xì)胞質(zhì)的黏滯度和降低冰點等作用起到對精子的低溫保護(hù)。一方面, 隨著抗凍劑濃度的增加, 精子的保護(hù)作用加強(qiáng); 另一方面, 抗凍劑本身所具有的毒性又是其使用量的限制因子。章龍珍等[28]研究發(fā)現(xiàn)DMSO對淡水魚類精子滲透壓有調(diào)節(jié)作用, DMSO能滲透到精子里面提高精子滲透壓, 精子滲透壓隨DMSO平衡時間和DMSO濃度增加而提高因提高滲透壓而降低冰點使精子在結(jié)冰前得以快速通過(0～60℃)危險溫區(qū)[29]。陳松林等[30]研究也發(fā)現(xiàn)DMSO是通過滲入到細(xì)胞內(nèi)、提高胞內(nèi)滲透壓而起到抗凍保護(hù)作用。從本實驗的結(jié)果也得出DMSO的保存效果優(yōu)于甘油。雖然甘油滲透力弱, 能降低原生質(zhì)冰點到-35℃左右。但與甘油相比, DMSO滲透力強(qiáng), 親水性好, 能與電解質(zhì)鰲合從而降低細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)的濃度, 進(jìn)而使細(xì)胞內(nèi)保持水分, 使原生質(zhì)冰點降低到-40℃, 所以保存效果優(yōu)于甘油。且本實驗中隨著DMSO、甘油體積分?jǐn)?shù)的增加, 保存效果也越來越好, 保存效果最佳的是15%DMSO, 但當(dāng)體積分?jǐn)?shù)達(dá)到20%, 保存效果下降。因為體積分?jǐn)?shù)達(dá)到一定數(shù)值時, 抗凍劑濃度過高, 抗凍劑產(chǎn)生了毒副作用, 因此在添加抗凍劑時應(yīng)當(dāng)注意濃度的選擇。

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