溫玉蘭陳 會鄧林強胡錦輝張國強劉春風

（1 南昌市第三醫(yī)院，江西 南昌 330000；2 江西省人民醫(yī)院，江西 南昌 330000；3 南昌市第二醫(yī)院，江西 南昌 330000）

自溶素（lytA）基因限制性片段長度多態(tài)性用于肺炎鏈球菌鑒定的實驗研究

溫玉蘭1陳 會2鄧林強2胡錦輝1張國強3劉春風1

（1 南昌市第三醫(yī)院，江西 南昌 330000；2 江西省人民醫(yī)院，江西 南昌 330000；3 南昌市第二醫(yī)院，江西 南昌 330000）

目的 建立一種適用于臨床的、操作簡單的、高特異性的肺炎鏈球菌分子生物學鑒定技術(shù)。方法 選取臨床分離的肺炎鏈球菌 102株及其他草綠色鏈球菌 51 株，分別采用 OPT 敏感試驗、膽汁溶菌試驗、商品化鑒定系統(tǒng)及自溶素基因片段長度多態(tài)性技術(shù)進行鑒定。結(jié)果 102 株肺炎鏈球菌中 101 株 OPT 抑菌環(huán)直徑≥ 14mm，其中 17 株介于 14 ～ 19mm 之間，1 株為 OPT 耐藥肺炎鏈球菌，抑菌環(huán)僅6mm；102 株膽汁溶菌試驗結(jié)果均為陽性；自動化鑒定系統(tǒng)鑒定準確率為 93.1%。51 株草綠色鏈球菌中 19 株 OPT 出現(xiàn)抑菌環(huán)，其中 7 株抑菌環(huán)≥ 14mm；膽汁溶菌試驗均為陰性。自溶素（lytA）基因限制性片段長度多態(tài)性對 102 株肺炎鏈球菌鑒定準確率為 100%，且能完全區(qū)分其它草綠色鏈球菌。結(jié)論 自溶素基因限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)對肺炎鏈球菌鑒定具有很高的特異性和敏感性，臨床可作為傳統(tǒng)鑒定的方法學補充。

肺炎鏈球菌；自溶素；限制性片段長度多態(tài)性；鑒定

肺炎鏈球菌（streptococcus pneumoniae）是社區(qū)獲得性肺炎的主要病原體，亦與菌血癥、腦膜炎、中耳炎、鼻竇炎、角膜炎等相關(guān)，在世界上具有很高的發(fā)病率和病死率（尤其是老人和兒童）[1]?？焖?、準確的肺炎鏈球菌鑒定有助于于及時、有效的診斷治療肺炎鏈球菌感染。本文采用PCR結(jié)合限制性內(nèi)切酶酶切技術(shù)對肺炎鏈球菌及其他草綠色鏈球菌群的臨床分離株進行研究，一方面試圖建立一種適用于臨床的、操作簡單的、高特異性的肺炎鏈球菌分子生物學鑒定技術(shù)，彌補傳統(tǒng)鑒定方法學及其他分子技術(shù)的不足，避免誤診誤治及抗生素濫用；另一方面，也為進一步研究細菌感染性疾病的實驗室分子診斷方法學打下基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

①肺炎鏈球菌：共102株，其中100株為2009年1月至2010年12月間我院臨床分離，分別編號sp1～sp102。②其他草綠色鏈球菌：共51株，包括49株草綠色鏈球菌和2株呈草綠色溶血的糞腸球菌，編號sv1～sv51。③菌株保存 所有實驗菌株初次分離后，采用5%哥倫比亞羊血瓊脂分純，接種于專用菌種保存培養(yǎng)基（Microbank管），-70° C凍存?zhèn)溆?。④質(zhì)控菌株：ATCC49619肺炎鏈球菌。

1.2 OPT敏感實驗

對所有實驗菌株均進行OPT敏感試驗，抑菌環(huán)直徑＞14mm為敏感。OPT紙片購自英國OXIOD公司。

1.3 膽汁溶菌實驗

對所有實驗菌株均采用試管法進行膽汁溶菌試驗。分別取1mL 6麥氏單位菌液于2個試管中，于1管菌液中加0.1 mL10%膽鹽溶液（去氧膽酸鈉），另一管中加0.1 mL無菌生理鹽水，混勻后，置35℃孵箱15 min取出，搖勻后觀察結(jié)果。加鹽水管菌液濁度不變（或基本不變），加膽鹽溶液管菌液變澄清，判為膽汁溶解試驗陽性。

1.4 自動化鑒定

采用美國BD公司phenix 100細菌全自動鑒定藥敏系統(tǒng)對所有實驗菌株進行鑒定，接種、孵育及結(jié)果判斷均嚴格按試劑盒操作說明進行。

1.5 分子生物學鑒定

1.5.1 模板DNA提取（細菌染色體DNA）

商品化試劑盒購自X北京全式金生物技術(shù)有限公司，操作嚴格按照說明書進行。

1.5.2 引物設計

，選擇一對引物[18]，LA5-Ext：5'-AAGCTTTTTAGTCTG GGGTG-3'；LA3-Ext：5'-AAGCTTTTTCAAGACCTAATAATATG-3'，引物由北京全式金生物技術(shù)有限公司合成，每條引物合成后OD值均不＜5.0。采用這對引物無論是對肺炎鏈球菌或其他Smit群模板DNA PCR擴增均可獲取長1213bp的目的片段，且這一片段包含lytA基因（典型或不典型），見圖1。

1.5.3 PCR擴增

總反應體系體積50μL，含0.5UTaq酶，250μM DdNTP，引物LA5-Ext及LA3-Ext各0.5μM，模板DNA0.5μg及標準緩沖液。預變性95°C 5mins，隨后進行25個擴增循環(huán)，每個循環(huán)均為95°C變性30s-52°C退火30s-72°C延伸1min。取PCR擴增產(chǎn)物10μL，加3μL載樣緩沖液混勻，2%瓊脂糖凝膠電泳（90V，45mins），溴化乙錠染色，紫外燈下觀察，結(jié)合DNA Marker判斷目的片段。

圖1 lytA基因（典型和非典型序列）：數(shù)字1指啟動編碼子ATG的第1位核苷酸；圖下方條形框代表非典型lytA基因6bp缺失所在位置；上方條形框代表典型lytA基因和非典型lytA基因102不同位點所在位置（22～927）；條形框內(nèi)5個綠色區(qū)域及區(qū)域內(nèi)數(shù)字分別代表不同位點集中區(qū)域及位點數(shù)

圖2 1：DNA Marker；2：OPT敏感的緩癥鏈球菌；3：口腔鏈球菌；4：肺炎鏈球菌ATCC 49619；5：OPT敏感株；6：OPT不敏感株

圖3 1：糞腸球菌；2：口腔鏈球菌；3：OPT敏感的緩癥鏈球菌；4：DNA Marker ；5：肺炎鏈球菌ATCC 49619；6：OPT敏感株；7：OPT不敏感株

圖4 OPT耐藥的肺炎鏈球菌

1.5.4 結(jié)果判斷

出現(xiàn)1213bp條帶為擴增陽性（該菌株包含lytA基因），不出現(xiàn)為擴增陰性（該菌株不含lytA基因）。見圖2。

1.5.5 擴增陽性產(chǎn)物限制性內(nèi)切酶分析

BsaAI酶及DNA Marker（分子量標準）均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。采用BsaAI 對PCR擴增產(chǎn)物進行消化，按試劑盒說明書進行。取酶切后產(chǎn)物10μL，2%瓊脂糖凝膠電泳（90V，45mins），結(jié)合DNA Marker判斷。若出現(xiàn)761bp、452bp兩條帶即為典型的肺炎鏈球菌lytA基因；若出現(xiàn)362bp、851bp兩條帶則為不典型lytA基因（圖3所示）。

2 結(jié) 果

2.1 102株肺炎鏈球菌常規(guī)鑒定

2.1.1 102株肺炎鏈球菌OPT試驗結(jié)果：肺炎鏈球菌sp1-sp101 OPT抑菌環(huán)均≥14mm，但其中有17株抑菌環(huán)介于14～19mm之間，sp102為OPT耐藥肺炎鏈球菌，抑菌環(huán)僅6mm（圖4）。

2.1.2 102株肺炎鏈球菌膽汁溶菌試驗結(jié)果：102株肺炎鏈球菌膽汁溶菌試驗均呈陽性。

2.1.3 102株肺炎鏈球菌自動化鑒定結(jié)果：102株肺炎鏈球菌，95株鑒定為肺炎鏈球菌，鑒定準確率為93.1%；3株鑒定錯誤，其中2株報告為緩癥鏈球菌，1株為口腔鏈球菌；4株未能給出鑒定結(jié)果。

2.2 51株草綠色鏈球菌（含2株糞腸球菌）鑒定結(jié)果

2.2.1 51株草綠色鏈球菌OPT試驗結(jié)果：51株草綠色鏈球菌有19株OPT出現(xiàn)抑菌環(huán)，其中7株抑菌環(huán)≥14mm。

2.2.2 51株草綠色鏈球菌膽汁溶菌試驗結(jié)果：51株均呈現(xiàn)陰性。

2.2.3 51株草綠色鏈球菌自動化鑒定結(jié)果：51株菌中，緩癥鏈球菌11株、口腔鏈球菌5株、血液鏈球菌8株、星座鏈球菌6株、唾液鏈球菌8株、咽峽炎鏈球菌4株、糞腸球菌2株、其它7株。

2.3 自溶素（lytA）基因限制性片段長度多態(tài)性鑒定

2.3.1 對102株肺炎鏈球菌臨床分離株及肺炎鏈球菌ATCC49619，進行PCR擴增均可獲取1213bp片段，進一步對所獲片段進行BsaAI酶切，均可獲取761bp、452bp目的片段（圖3）。

2.3.2 對51株草綠色溶血鏈球菌進行上述相同PCR擴增，結(jié)果僅SMG群鏈球菌（緩癥鏈球菌11株、口腔鏈球菌5株）出現(xiàn)1213bp目的片段，其余35株（包括2株糞腸球菌）均未能獲取目的片段，對未能獲取目的片段的菌株依據(jù)結(jié)果判斷標準鑒定為非肺炎鏈球菌。對16株SMG群鏈球菌擴增所獲片段進行BsaAI酶切，均獲取362bp、851bp目的片段，依據(jù)結(jié)果判斷標準，鑒定為非肺炎鏈球菌（圖3）。

3 討 論

目前臨床實驗室對肺炎鏈球菌鑒定主要依賴于其四個主要的表型特征[3]：血瓊脂平板上菌落特點（臍窩狀，草綠色溶血）、Optochin紙片敏感實驗（OPT）、膽汁（去氧膽酸鹽）溶菌實驗（BS）、免疫學反應（型特異性抗血清反應、莢膜腫脹實驗）及自動化鑒定系統(tǒng)。其中，前三種尤其是OPT實驗為臨床實驗室鑒定肺炎鏈球菌常用手段。由于方法學局限及肺炎鏈球菌生物學變異，僅憑借上述方法可能使部分菌株的鑒定出現(xiàn)錯誤。

一些肺炎鏈球菌，如果培養(yǎng)時間不足或培養(yǎng)前抗生素的使用，則不具備典型的菌落形態(tài)，若分離有菌部位如呼吸道標本，很難與其它草綠色鏈球菌相區(qū)別；optochin試驗，抑菌環(huán)直徑≥14 mm 為敏感，肺炎鏈球菌的抑制環(huán)直徑常在20mm以上。草綠色溶血性鏈球菌（約98%）＜12mm。一般來說，通過optochin藥敏試驗，肺炎鏈球菌可得到準確鑒定。但optochin耐藥的肺炎鏈球菌菌株已經(jīng)出現(xiàn)[4]，此外，optochin對草綠色溶血性鏈球菌部分菌種也呈現(xiàn)抑菌作用，抑菌環(huán)多在14～17mm，本研究中51株草綠色鏈球菌有16株OPT出現(xiàn)抑菌環(huán)，其中7株抑菌環(huán)≥14mm；膽汁溶菌試驗，膽汁不溶的肺炎鏈球菌已有報道，一些肺炎鏈球菌菌落膽汁不溶甚至同時表現(xiàn)BS陰性和OPT耐藥，而且即便是方法改進，BS實驗的敏感性僅能達到98%[5]；免疫學反應基于肺炎鏈球菌莢膜抗原與特異性抗血清之間的凝集反應，然而一些肺炎鏈球菌不存在莢膜，則可能導致假陰性，另外，抗血清可能與一些非肺炎鏈球菌的草綠色鏈球菌群存在交叉反應，從而導致假陽性結(jié)果[6]；隨著科技進步，細菌鑒定手段不斷豐富，以生化表型為基礎的自動、半自動鑒定系統(tǒng)已成為各級臨床微生物學實驗室常用手段。但是，由于方法學局限及一些技術(shù)原因，對于肺炎鏈球菌的鑒定，均未能達到滿意效果，本研究中，102株肺炎鏈球菌，95株鑒定為肺炎鏈球菌，鑒定準確率為93.1%；3株鑒定錯誤，其中2株報告為緩癥鏈球菌，1株為口腔鏈球菌；4株未能給出鑒定結(jié)果。

因此，上述問題的存在，一方面導致部分肺炎鏈球菌感染漏診，耽誤患者病情；另一方面，也可能將一些非肺炎鏈球菌的草綠色鏈球菌群錯誤地鑒定為肺炎鏈球菌，如此則可能誤導臨床用藥，加重患者經(jīng)濟負擔，同時導致出現(xiàn)不客觀的相關(guān)流行病學統(tǒng)計資料[肺炎鏈球菌耐藥率及PRSP（penicillin resistant streptococcus pneumonia，耐青霉素肺炎鏈球菌）的發(fā)生率]假性增高。因此，尋找一種快速準確的肺炎鏈球菌鑒定技術(shù)具有重要意義。

隨著分子生物學技術(shù)尤其是聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)的迅猛發(fā)展，肺炎鏈球菌遺傳物質(zhì)的特點逐漸被闡明，使得采用分子生物學手段對肺炎鏈球菌進行鑒定成為當前這一領域的研究熱點。國內(nèi)外研究者們采用多種分子手段進行了研究：①采用PCR手段擴增肺炎鏈球菌毒力因子自溶素（autolysin，lytA）、溶血素（pneomolysin，ply）和青霉素結(jié)合蛋白（penicillin binding protein，PBP）編碼基因[7-9]；②對肺炎鏈球菌16S rRNA 基因（16S rDNA ）的特異性區(qū)域進行DNA探針雜交[10]；③肺炎鏈球菌看家基因如xpt，recP，HexB，ddl以及錳依賴的超氧化物歧化酶基因（sodA）PCR擴增[11-14]；④DNA-DNA reassociation，一種基于DNA雜交的鑒定技術(shù)，對于肺炎鏈球菌典型菌株，其DNA-DNA相似值超過70%，而其他Smit群如緩癥鏈球菌、口腔鏈球菌與肺炎鏈球菌比較，基因組DNA-DNA之間相似值＜60%[15]。這些分子技術(shù)用于肺炎鏈球菌鑒定都曾被認為是可靠的、充分的手段，但隨著研究的深入，這些方法的局限性和不足亦越來越明確。首先，有報道[13,14]認為除肺炎鏈球菌外的其他Smit群成員也具有l(wèi)ytA基因或具有l(wèi)ytA基因相似的基因片段，因此，單純依賴PCR擴增確定lytA基因存在與否鑒定肺炎鏈球菌會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；其次，Kawamura等[15]和Whatmore 等[14]均報道一些緩癥鏈球菌和口腔鏈球菌分離株基因組也包含ply基因，即便是檢測到ply基因也無法準確區(qū)分肺炎鏈球菌和其他 Smit群成員；16S rRNA 基因序列用于肺炎鏈球菌鑒定也具有一定的局限性，Smit群內(nèi)不同種之間具有遺傳相似性，DNA-DNA同源性研究表明，Smit群內(nèi)不同成員之間DNA相似性達40%～60%，且典型的緩癥鏈球菌、口腔鏈球菌和肺炎鏈球菌菌株的16S rRNA基因之間的同源性高達99%以上，因此DNA探針雜交檢測16S rRNA 基因也無法準確鑒定肺炎鏈球菌[10-14]；此外，雖然DNA-DNAreassociation技術(shù)被認為是鑒定菌株至種的一種金標準，是區(qū)分Smit群內(nèi)不同種的一種最為精準的手段，然而由于技術(shù)難度大，操作煩瑣，不可能作為臨床實驗室的常用手段。

最近，Llull等[2]從EMBL數(shù)據(jù)庫上公布的不同分離株的lytA基因序列數(shù)據(jù)中，選擇一些完整或接近完整的序列（至少包含第22位核苷酸～第957位核苷酸[約占總基因長度95%]）。共獲取29株肺炎鏈球菌和22株其他Smit群細菌的lytA序列，并對其中19株肺炎鏈球菌和20株其他Smit群細菌的lytA序列進行詳細的比較分析，得出如下結(jié)論：①證實了前人研究成果，即典型的lytA基因序列（肺炎鏈球菌）長度為957bp，而非典型的lytA基因序列（其他Smit群）長度為951bp，非典型lytA基因在第868位核苷酸～第873位核苷酸之間存在6bp的缺失（圖1）；②典型的lytA基因序列和非典型的lytA基因序列之間，共有102個位點（包括上述6bp 缺失）呈現(xiàn)不同，而且這些位點均集中在第22～927位核苷酸之間的5個不同區(qū)域內(nèi)（圖1）。進一步研究發(fā)現(xiàn)，典型的lytA基因序列中包含SnaBI酶切位點（酶切位置位于第561和562位核苷酸之間），而這一位點在非典型的lytA基因序列中并不存在（圖1）；相反，非典型lytA基因序列中包含XmnI酶切位點（酶切位置位于第290和291位核苷酸之間），而這一位點在典型的lytA基因序列中并不存在；此外由于SnaBI酶切位點（TAC↓GTA）同時也是BsaAI的酶切位點（PyAC↓GTPu），對非典型lytA基因序列分析發(fā)現(xiàn)，所有的序列均僅在160～165位核苷酸之間存在一個BsaAI的酶切位點。lytA基因序列（典型和非典型）限制性片段長度多態(tài)性特點的明確，使得采用PCR結(jié)合限制性酶切技術(shù)很容易將典型的lytA基因（肺炎鏈球菌）和非典型lytA基因（其他Smit群）區(qū)分開來。迄今為止，除Llull等外，國內(nèi)外尚未見相關(guān)報道。

本研究利用這一研究成果，對分離自臨床的102株肺炎鏈球菌及肺炎鏈球菌ATCC49619進行鑒定，所有菌株經(jīng)過PCR擴增均能獲取1213bp的DNA片段，選用BsaAI進行酶切，均能獲取761bp、452bp兩個DNA片段，依據(jù)結(jié)果判斷標準，鑒定率為100%。對51株草綠色溶血性鏈球菌進行同樣操作，其中35株（包括兩株糞腸球菌）PCR未能獲取目的片段，16株SMG群（11株緩癥鏈球菌和5株口腔鏈球菌）PCR可獲取1213bpDNA片段，但經(jīng)過BsaAI進行酶切后獲取的兩個目的片段分別為362bp、851bp。依據(jù)結(jié)果判斷標準，均為非肺炎鏈球菌。我們的研究結(jié)果進一步證實了Llull等的觀點，并為將之廣泛應用于臨床打下了堅實的基礎。

綜上所述，自溶素基因限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)對肺炎鏈球菌鑒定具有很高的特異性和敏感性，優(yōu)于其他分子生物學鑒定技術(shù)。其操作相對簡便，實驗室技術(shù)及設備要求不高，臨床可常規(guī)開展作為肺炎鏈球菌傳統(tǒng)鑒定方法學的補充。

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R378.1+2

：B

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