王彩鳳，敖敦格日勒，小 琴，特尼格爾，趙 慧，格日勒?qǐng)D

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

S-層蛋白質(zhì)（S-layer protein，SLP）是指由一層晶格狀排列的單分子蛋白或糖蛋白亞單位組成的胞漿外層結(jié)構(gòu)［1］。它是位于某些革蘭陽(yáng)性細(xì)菌和革蘭陰性細(xì)菌以及古細(xì)菌的細(xì)胞表面獨(dú)特結(jié)構(gòu)，其厚度通常約為5nm～15nm，分子質(zhì)量約為40ku～200ku，而乳酸桿菌的S-層蛋白質(zhì)分子質(zhì)量相對(duì)較小，約為25ku～71ku［2］。與其他細(xì)菌的SLP 相比，乳酸菌SLP的顯著特點(diǎn)是分子量小、等電點(diǎn)高。幾乎所有SLP均可自組裝成二維的傾斜的、正方形的、六邊形的對(duì)稱晶格結(jié)構(gòu)，覆蓋在整個(gè)菌體表面，以非共價(jià)鍵相互作用。

研究表明，無(wú)論是在溶液中還是多種固相載體上，SLP 可以在熵的驅(qū)動(dòng)下自組裝成晶格結(jié)構(gòu)［3］。這一特點(diǎn)使其在納米技術(shù)、納米生物技術(shù)領(lǐng)域備受研究者青睞。如借助基因工程技術(shù)，將SLP 的基因克隆至合適的表達(dá)載體中，獲得的重組SLP 的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)并未發(fā)生變化［4］。甚至經(jīng)過(guò)遺傳改造，原本不具有黏附能力的乳酸菌，通過(guò)表達(dá)了SLP 以后可獲得黏附能力［5］。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，乳酸桿菌SLP因其高度規(guī)則的結(jié)構(gòu)，顯著的黏附能力和自組裝能力，可望發(fā)展為潛在的免疫治療和預(yù)防的候選材料，如藥物靶標(biāo)、疫苗和活性抗原遞呈載體［6］。此外，SLP可作為毒力因子在確定和維持細(xì)胞的形狀上起作用［7］，也可作為細(xì)胞黏附的介質(zhì)物，也可作為未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞和T 細(xì)胞的調(diào)節(jié)器［8］，還可作為保護(hù)層，分子篩，胞壁質(zhì)水解酶等發(fā)揮作用［9］。而乳酸菌的SLP在異源蛋白質(zhì)的分泌性表達(dá)甚至表面展示等方面有著更廣闊的應(yīng)用前景。

本研究應(yīng)用基因工程技術(shù)克隆短小乳桿菌（Lactobacillus brevis）內(nèi)蒙古分離株的slp基因，獲得其大腸埃希菌表達(dá)產(chǎn)物并進(jìn)行鑒定，最后對(duì)純化的重組SLP的黏附特性進(jìn)行初步鑒定和分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒E.coliDH5α、E.coliBL21（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)研究中心分離并保存）；乳酸乳球菌NZ9000（購(gòu)自荷蘭）；載體pGEX-4T-3（Invitrgen）；重組質(zhì)粒pMD19T-slp（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)研究中心構(gòu)建）。

1.1.2 主要試劑 普通質(zhì)粒小提取試劑盒（TIANGEN），BCA 蛋白定量試劑盒（康為世紀(jì)公司），XhoⅠ、BamHⅠ、TaqDNA 聚合酶、T4DNA 連接酶、膠回收試劑盒（TaKaRa），鼠抗GST 血清（日本帶廣畜產(chǎn)大學(xué)原蟲(chóng)病研究中心制備），山羊抗鼠IgGHRP（Invitrogen），透析袋（上海西諾公司），96孔酶標(biāo)板（康公司寧）；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 引物設(shè)計(jì) 應(yīng)用Primer Premier v5.0生物軟件設(shè)計(jì)以下一對(duì)引物：

P1：5′-GACGGATCCATCGTGAGCGCTGCTG-3′（劃線部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn)）

P2：5′-GCTCTCGAGCTAGAGATTGTAAACG-3′（劃線部分為XhoⅠ酶切位點(diǎn)）。引物由上海桑尼生物科技公司合成。

1.2 方法

1.2.1 原核表達(dá)載體pGEX-slp 的構(gòu)建及鑒定以重組質(zhì)粒pMD19T-slp為模板，應(yīng)用PCR 方法擴(kuò)增出的片段，經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切得到slp目的片段，插入到相同酶處理的原核表達(dá)載體pGEX-4T-3中，成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-slp并進(jìn)行鑒定。

1.2.2 slp基因IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化 首先將重組質(zhì)粒pGEX-slp和質(zhì)粒pGEX-4T-3（空載體）轉(zhuǎn)化至E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞中，在Amp抗性的LB平板上挑取陽(yáng)性菌落，轉(zhuǎn)接到3 mL LB 培養(yǎng)基中于37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，次日將此培養(yǎng)物按1∶100比例轉(zhuǎn)接于20mL LB中，于37 ℃、200r／min搖菌培養(yǎng)至OD600nm 值為0.5～0.7 時(shí)，加入適量的IPTG（終濃度為1mmol／L）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)5h。并按0h（加入IPTG 之前）、0.5、1、2、3、4、5h 各取1mL菌液留樣，離心收集菌體，加入1×SDS-PAGE上樣緩沖液制備樣品，進(jìn)行SDS-PAGE 分析。以同樣的方法，將過(guò)夜培養(yǎng)物按1∶100 比例轉(zhuǎn)接于5mL LB中，于37 ℃培養(yǎng)至OD600nm 值為0.5～0.7 時(shí)，加入不同終濃度的IPTG（0.5、1.0、1.5、2.0、3.0mmol／L）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)5h。以同樣的方法制備樣品，進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.3 Western blot鑒定重組融合蛋白GST-SLP根據(jù)1.2.2試驗(yàn)確定的最佳IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行誘導(dǎo)，制備樣品，首先進(jìn)行SDS-PAGE 分析，然后按常規(guī)方法將凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。其中第一抗體為鼠抗GST 血清，第二抗體為山羊抗鼠IgG-HRP，底物為DAB。常規(guī)方法進(jìn)行顯色觀察結(jié)果并記錄。

1.2.4 純化和鑒定重組融合蛋白GST-SLP 根據(jù)1.2.2試驗(yàn)確定的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件，將重組菌種轉(zhuǎn)接于1 000mL LB中，于37 ℃200r／min培養(yǎng)至OD600nm 值 為0.5～0.7 時(shí)，加入終濃度為3.0mmol／L IPTG 誘導(dǎo)5h。離心收集菌體沉淀，用PBS（50mmol／L，pH 7.0）重新懸浮沉淀，超聲裂解菌體，離心棄上清，沉淀懸浮于5 mol／L LiCl溶液，于4℃靜置18h。離心取上清，于4℃將上清液在PBS 中透析18h，將透析液用蛋白質(zhì)濃縮儀濃縮，用SDS-PAGE 檢測(cè)純化情況。并用BCA 試劑盒檢測(cè)重組融合蛋白GST-SLP的濃度。

1.2.5 體外鑒定重組融合蛋白GST-SLP的黏附特性 30 ℃靜置培養(yǎng)乳酸乳球菌NZ9000至第3代，將培養(yǎng)物離心棄上清，沉淀用PBS 洗2 遍，濁度調(diào)至OD600nm＝1.0。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，將該菌液加入96孔酶標(biāo)板中4 ℃過(guò)夜包被，次日用30g／L脫脂乳封閉1.5h。加入純化的重組融合蛋白GSTSLP，取4個(gè)濃度梯度（110.0、55.0、36.7、27.5μg／mL），常溫結(jié)合1.5h。加入一抗溶液（鼠抗GST 血清，用30g／L脫脂乳按1∶1 000稀釋），常溫結(jié)合1.5h。加入二抗溶液（山羊抗鼠IgGHRP，用30g／L脫脂乳按1∶4 000稀釋），常溫結(jié)合1.5h。加入底物TMB 顯色，振蕩15s，室溫靜置15min，測(cè)OD652mm 值，再加終止液，測(cè)OD450mm值。本試驗(yàn)共設(shè)計(jì)3個(gè)對(duì)照組，分別去除了重組融合蛋白GST-SLP 與脫脂乳以及抗體與NZ9000表面、脫脂乳的非特異性結(jié)合的影響，最后算出4個(gè)濃度梯度下重組融合蛋白GST-SLP 與NZ9000表面特異性結(jié)合的凈值，即4 個(gè)濃度梯度的樣品組在450nm 處的凈吸光值，以此作一柱圖，并進(jìn)行誤差分析。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-slp的酶切鑒定

重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-slp經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后，得到約1 200bp的目的基因片段和約5 500bp的載體片段（圖1），與PCR 方法擴(kuò)增出的1 200bp特異性條帶大小相符（圖2）。

圖1 重組質(zhì)粒pGEX-slp的酶切鑒定Fig.1 Identification of the plasmid pGEX-slp by enzyme digestion

2.2 重組表達(dá)載體pGEX-slp最佳IPTG誘導(dǎo)表達(dá)條件的確定

圖2 slp基因PCR 產(chǎn)物Fig.2 PCR products of slp gene

經(jīng)SDS-PAGE 方法檢測(cè)，結(jié)果表明，成功表達(dá)了重組GST 蛋白和重組融合蛋白GST-SLP，其大小分別約為27ku 和71ku，與預(yù)計(jì)理論值大小相符。IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)的最佳時(shí)間條件和最佳濃度條件分別為5h（圖3）和3.0mmol／L（圖4）。

圖3 不同時(shí)間IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)的結(jié)果Fig.3 Expression results of different time induced by IPTG

圖4 不同濃度IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)的結(jié)果Fig.4 Expression results of different IPTG concentrations

2.3 重組融合蛋白GST-SLP的Western blot檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)Western blot檢測(cè)，重組融合蛋白GST-SLP能被鼠抗GST 血清所識(shí)別，分別約在約71ku 和27ku處有特異性反應(yīng)條帶；而對(duì)照組重組GST 蛋白則在約27ku處同樣出現(xiàn)了特異性的條帶，該結(jié)果與實(shí)際情況相符合（圖5）

2.4 重組融合蛋白GST-SLP的純化結(jié)果

采用最佳的濃度和時(shí)間誘導(dǎo)條件進(jìn)行大量誘導(dǎo)后，收集菌體沉淀，經(jīng)超聲波破碎、5mol／L LiCl溶液處理、透析、濃縮，得到純化的蛋白樣品，結(jié)果如圖6所示，SDS-PAGE顯示71ku處有一條優(yōu)勢(shì)條帶，其濃度約為1.1mg／mL。

2.5 重組融合蛋白GST-SLP的ELISA 鑒定結(jié)果

根據(jù)4個(gè)濃度梯度的樣品組在450nm 處的凈吸光值作一柱圖，分析重組融合蛋白GST-SLP 與NZ9000表面的黏附特性強(qiáng)弱，試驗(yàn)結(jié)果如圖7 所示，顯示呈陽(yáng)性，可初步證明當(dāng)重組融合蛋白GSTSLP濃度為110.0μg／mL 時(shí)，與NZ9000表面有較強(qiáng)的黏附特性；但是當(dāng)濃度低時(shí)，它與NZ9000表面的黏附特性則較弱。

圖5 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot鑒定Fig.5 Analysis of the expressed products by Western blot

圖6 純化的重組融合蛋白GST-SLP的電泳分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of purified recombinant fusion protein GST-SLP

圖7 重組融合蛋白GST-SLP的ELISA 分析Fig.7 ELISA analysis of recombinant fusion protein GST-SLP

3 討論

細(xì)菌表面SLP 是體內(nèi)和體外納米生物技術(shù)應(yīng)用方面的最優(yōu)秀的候選蛋白，因?yàn)樗哂凶越M裝成二維晶格的能力，這種晶格形成了某些細(xì)菌表面的最外層結(jié)構(gòu)［2，6，10］。乳酸桿菌作為人和動(dòng)物消化道中重要的正常微生物，國(guó)外學(xué)者利用SLP的特性已在乳酸桿菌細(xì)胞表面成功展示了一些生物活性蛋白質(zhì)或多肽，即通過(guò)基因工程方法使外源蛋白表達(dá)并展示到細(xì)菌的細(xì)胞外膜上［2］。據(jù)報(bào)道，乳酸桿菌對(duì)小腸的黏附作用與SLP 有 關(guān)［2，11-12］。Khang Y H等［6］利用短小乳桿菌SLP 黏附于腸上皮細(xì)胞的特性，成功利用短小乳桿菌重組SLP來(lái)介導(dǎo)抗體黏附于小牛腸細(xì)胞從而有效地預(yù)防了新生牛腹瀉綜合癥。

本試驗(yàn)成功克隆了短小乳桿菌SLP 基因slp，原核表達(dá)并鑒定表達(dá)產(chǎn)物，最后對(duì)純化的重組SLP的黏附特性進(jìn)行了初步鑒定。應(yīng)用PCR 方法正確擴(kuò)增slp基因獲得約1 200bp的片段，這與相關(guān)報(bào)道［13］的結(jié)果一致。用IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)重組表達(dá)載體pGEX-slp，發(fā)現(xiàn)影響表達(dá)的主要因素包括：細(xì)菌生長(zhǎng)期、細(xì)胞生長(zhǎng)速率和IPTG 誘導(dǎo)濃度。因?yàn)榧?xì)胞生長(zhǎng)速率對(duì)外源蛋白的表達(dá)也有影響，所以誘導(dǎo)時(shí)機(jī)和誘導(dǎo)物的用量必須嚴(yán)格控制。而在生長(zhǎng)不足或過(guò)度都會(huì)使外源蛋白降低表達(dá)量，甚至不表達(dá)。IPTG 的濃度適宜對(duì)表達(dá)外源基因十分重要，本試驗(yàn)已確定的IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)的最佳溫度為37 ℃，最佳IPTG 濃度為3.0mmol／L，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為5h。

S-層蛋白以非共價(jià)鍵與宿主表面結(jié)合。為了研究乳酸菌S-層蛋白的一些性質(zhì)，有時(shí)需要將其從細(xì)胞表面提取出來(lái)。常用的提取方法是高濃度變性劑處理的方法，如尿素、鹽酸胍、氯化鋰、金屬螯合劑及陽(yáng)離子置換劑等［14］。本試驗(yàn)采用的高濃度變性劑是氯化鋰。由于S-層蛋白具有自我組裝特性，因此提取的S-層蛋白液體透析去除變性劑后，又可以自動(dòng)聚集為有活性的S-層蛋白。提取的S-層蛋白應(yīng)用SDS-PAGE 方法進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示在71ku處有一優(yōu)勢(shì)條帶，證明本試驗(yàn)已獲得了較高純度的重組融合蛋白GST-SLP，這是進(jìn)行其體外黏附特性的鑒定試驗(yàn)的前提條件。

重組SLP的體外黏附特性鑒定試驗(yàn)結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)在高濃度時(shí)與NZ9000 表面黏附效果較強(qiáng)，而低濃度時(shí)黏附效果則較弱，這種濃度依賴性是與重組蛋白質(zhì)純化方法有關(guān)或是S-層蛋白其本身活性的改變導(dǎo)致或是融合外源性蛋白質(zhì)的原因，尚需要進(jìn)一步試驗(yàn)研究來(lái)證實(shí)。

［1］雙 杰，包秋華，永 勝，等.幾種乳酸菌S-層蛋白的普查以及slp基因的克隆與序列分析［J］.中國(guó)乳品工業(yè)，2010，38（8）：8-10.

［2］Hu Shumin，Kong Jian，Sun Zhilan，et al.Heterologous protein display on the cell surface of lactic acid bacteria mediated by the s-layer protein［J］.Microbial Cell Factories，2011，10：1-13.

［3］Toca-Herrera J L，Krastev R，Bosio V，et al.Recrystallization of bacterial S-layers on flat polyelectrolyte surfaces and hollow polyelectrolyte capsules［J］.Formation of Biomimetic Surfaces，2005，1（3）：339-348.

［4］Sleytr U B，Egelseer E M，Ilk N，et al.S-layers as a basic building block in a molecular construction kit［J］.FEBS，2007，274（2）：323-334.

［5］Avall-Jaaskelainen S，Palva A.Surface display of the receptorbinding region of theLactobacillus brevisS-layer protein inLactococcus lactisprovides nonadhesive lactococci with the a-bility to adhere to intestinal epithelial ceUs［J］.AEM，2003，69：2230-2236.

［6］Khang Y H，Park H Y，JeongY S，et al.Recombinant S-layer proteins ofLactobacillus brevismediating antibody adhesion to calf intestine alleviated neonatal diarrhea syndrome［J］.J Microbiol Biotechnol，2009，19（5）：511-519.

［7］王 凡，李曉清，劉 婷，等.乳酸桿菌S-層蛋白研究進(jìn)展［J］.中國(guó)飼料，2012，19（1）：34-36.

［8］Konstantinov S R，Smidta H，de Vos W M，et al.S layer protein A ofLactobacillus acidophilusNCFM regulates immature dendritic cell and T cell flinctions［J］.Mcrobiology，2008，105（49）：19474-19479.

［9］Acosta M P，Palomino M M，Allievi M C，et al.Murein hydrolase activity in the surface layer ofLactobacillus acidophilusATCC 4356［J］.Appl Environ Microbiol，2008，74（24）：7824-7827.

［10］Heikki V，Ulla H，Helga B L，et al.Surface location of individual residues of SlpA provides insight into theLactobacillus brevisS-layer［J］.J Bacteriol，2009，191（10）：3339-3349.

［11］朱珊珊，崔 雯，任曉明，等.乳酸桿菌黏附作用的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2009，36（7）：219-220.

［12］Silja A，Airi P.Lactobacillussurface layers and their applications［J］.FEMS Microbiol，2005，29：511-529.

［13］Miia J V，Airi P.Isolation of surface（S）layer protein carryingLactobacillusspecies from porcine intestine and faeces and characterization of their adhesion properties to different host tissues［J］.Vet Microbiol，2007，124：264-273.

［14］范郁冰.L.brevisM8S-層蛋白的黏附性及其引起Caco-2細(xì)胞蛋白質(zhì)差異表達(dá)研究［D］.湖南長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.