王 娟，孫 毅，程 龍，楊佳麗，石 娟，劉曉明，李 勇＊

（1.寧夏大學西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學生命科學學院，寧夏 銀川 750021）

灘羊是我國獨特的裘皮用綿羊品種，是國家二級動物保護品種，2001年被農(nóng)業(yè)部列入第一批畜禽品種保護名錄。其所產(chǎn)二毛皮毛色潔白，光澤悅目，花穗美觀。灘羊羔羊肉脂肪分布均勻，肉質(zhì)細嫩，腥味小，是“寧夏羊肉”的代表，已享譽全國。寧夏是灘羊的主產(chǎn)區(qū)，在保護灘羊種質(zhì)資源特色的同時，對灘羊繁育性能的改良是寧夏灘羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展的共性需求[1]。動物體細胞克隆技術(shù)為動物育種技術(shù)開辟了更廣泛的途徑，必將極大地提高動物育種的效率。也為我區(qū)動物育種產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了技術(shù)支撐。

在體細胞核移植中體細胞必須在卵母細胞內(nèi)進行重編程以恢復其全能性，而卵母細胞的成熟度則會直接影響體細胞的重編程。所以，卵母細胞的體外成熟，作為體細胞核移植過程中的一個重要環(huán)節(jié)被人們關(guān)注。自Edwards R G通過體外培養(yǎng)使小鼠、綿羊、猴、豬、牛、人[2]等哺乳動物的卵母細胞在體外獲得成熟后，許多科研工作者在卵母細胞的體外成熟上做了大量的工作，通過在卵母細胞體外培養(yǎng)液中添加血清[3]、雌激素[4]、促卵泡素（folliclestimulating hormone，F(xiàn)SH）、促黃體素（luteinizing hormone，LH）[5]等物質(zhì)，使哺乳動物卵母細胞體外成熟率得到不斷提高。隨著卵母細胞體外培養(yǎng)技術(shù)日益成熟，體外成熟的卵母細胞正在廣泛應(yīng)用于體外受精，用于擴繁優(yōu)良母畜。在體細胞核移植等胚胎工程的各個領(lǐng)域，卵母細胞的成熟的效果，成為用于動物模型及生物反應(yīng)器的生產(chǎn)的基礎(chǔ)條件。但是，不同的物種在卵母細胞體外成熟中還存在一定的差異，而有關(guān)灘羊的卵母細胞成熟的研究尚未見到系統(tǒng)的報道，因此，本研究擬通過探討不同濃度的FSH和LH及人絕經(jīng)期促性腺激素（human menopausal gonaclotxopin，HMG）對灘羊卵母細胞體外成熟的影響，旨在建立灘羊卵母細胞體外成熟體系，為灘羊體細胞核移和灘羊分子育種和優(yōu)良種畜擴繁奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 灘羊卵巢 從屠宰場采集剛屠宰的母羊卵巢，放于加有青鏈霉素生理鹽水的保溫瓶中，30℃，4h內(nèi)運回實驗室。

1.1.2 試劑 FSH、LH 和17β－E2購自寧波第二激素廠，HMG購自麗珠制藥公司；TCM199購自Gibco公司；青霉素、鏈霉素購自華北制藥股份有限公司；胎牛血清購自HyClone公司；牛血清白蛋白（Bovine Serum Album，BSA），丙酮酸鈉，谷氨酰胺，表皮生長因子，胰島素－轉(zhuǎn)鐵蛋白－亞硒酸鈉復合物Insulin－transferrin－sodium selenite media supplement，ITS），尿嘧啶，透明質(zhì)酸酶均購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 卵丘－卵母細胞復合體（cumulus oocyte complexes，COCs）的采集 收集到的卵巢用37℃的滅菌生理鹽水清洗1次，先剪去多余的脂肪和結(jié)締組織，再用生理鹽水沖洗3次～4次后，置于盛有采卵液培養(yǎng)皿中。切割法收集COCs細胞，將檢出的COCs分為分為 A，B，C 3級：A級，卵丘細胞完整，卵母細胞胞質(zhì)均勻；B級，卵丘細胞不完整，卵母細胞胞質(zhì)均勻；C級，卵母細胞裸露，或胞質(zhì)略有退化。選擇A級和B級進行培養(yǎng)。

1.2.2 卵母細胞的體外成熟培養(yǎng) 將收集到的A級、B級COCs用洗卵液清洗3次～4次，然后置于預(yù)平衡2h～3h含1mL成熟液的U型皿中，進行體外成熟培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為38.5℃，體積分數(shù)為5%CO2，飽和濕度，培養(yǎng)22h～24h。

采卵液：TCM199＋2.5mg／mlL 肝素鈉＋50mL／L FBS；洗卵液：TCM199＋20mL／L FBS；基礎(chǔ)成熟液（maturation medium，MM）：TCM199＋10mg／mL BSA ＋100×ITS＋50ng／mL EGF ＋1.5μg／mL 17β－E2＋ 50 μg／mL尿嘧啶＋2.5mmol／mL谷氨酰胺＋1mmol／L丙酮酸鈉；卵母細胞成熟液（oocyte maturation medium，OM ）Ⅰ：MM＋100μg／mL FSH＋20μg／mL LH；OMⅡ：基礎(chǔ)成熟液＋200μg／mL FSH＋40μg／mL LH；OM Ⅲ：基礎(chǔ)成熟液 ＋300μg／mL FSH＋60μg／mL LH；OM Ⅳ：基礎(chǔ)成熟液＋0.05IU／mL HMG；OMⅤ：基礎(chǔ)成熟液＋0.1IU／mL HMG；OMⅥ：基礎(chǔ)成熟液＋0.15IU／mL HMG；OM Ⅶ：基礎(chǔ)成熟液＋0.2IU／mL HMG；基礎(chǔ)成熟液組即為對照組。收集到的卵母細胞分6組使用不同的培養(yǎng)液進行體外成熟培養(yǎng)，同一試驗組重復3次～5次。

1.2.3 卵母細胞的成熟判定 將成熟培養(yǎng)后的COCs置于含3g／L透明質(zhì)酸酶的D－PBS液內(nèi)，用移液器輕輕吹打以除去成熟卵母細胞表面的卵丘細胞。在體視顯微鏡下，以異物針撥動卵母細胞進行觀察，觀察第一極體是否排出，來判定卵母細胞成熟。

1.2.4 試驗設(shè)計 以成熟培養(yǎng)液不加激素為對照組，在成熟培養(yǎng)液中分別添加100μg／mL FSH＋20μg／mL LH、200μg／mL FSH＋40μg／mL LH、300μg／mL FSH＋60μg／mL LH、0.05IU／mL HMG、0.1IU／mL HMG、0.15IU／mL HMG、0.2IU／mL HMG等，不同激素濃度為試驗組，將卵母細胞成熟培養(yǎng)研究不同激素濃度對卵母細胞體外成熟的影響。每組試驗進行5次避免人為因素造成的差異。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 結(jié)果用卡方檢驗進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 添加不同濃度FSH和LH時灘羊卵母細胞體外成熟結(jié)果

在成熟液中添加不同濃度的FSH和LH對灘羊卵母細胞體外成熟有不同程度的影響，COCs在體外培養(yǎng)22h時，都可以觀察到卵丘細胞不同程度的擴散（圖1）。隨著添加激素濃度的升高，卵丘細胞擴散度增加，其中擴散直徑，空白對照（圖1A）＜OMⅠ（圖1B）＜OMⅠ（圖1C）＜OMⅢ（圖1D）。但試驗中發(fā)現(xiàn)，當激素FSH＞300μg／mL，LH＞60μg／mL時，卵丘細胞的擴散直徑不再增加，這表明，添加激素對灘羊卵母細胞的卵丘細胞細胞擴散有著一定的影響作用。同時運用imageJ2x軟件測定不同激素濃度下卵母細胞在卵丘細胞包裹中的投影計算激素對卵母細胞的影響。測定結(jié)果運用SPSS軟件分析，結(jié)果表明不添加激素的對照組的擴散距離與OMⅠ、OMⅡ和OMⅢ的擴散距離差異性顯著。OMⅠ、OMⅡ和OMⅢ的擴散距離差異性不顯著。但OMⅡ中的卵母細胞擴增距離優(yōu)于OMⅠ和OMⅢ中的卵母細胞擴增距離，如圖2顯示（擴散直徑對應(yīng)圖1次序）。

另外，在灘羊卵母細胞成熟培養(yǎng)液中添加不相同濃度的FSH和LH對卵母細胞成熟率不同，成熟培養(yǎng)液中加入100μg／mL FSH和20μg／mL LH成熟率為57.9%，與對照組差異顯著（P＜0.05）。添加200μg／mL FSH和40μg／mL LH的OM Ⅱ成熟率為68.8%，與對照組差異顯著（P＜0.05）。添加300μg／mL FSH和60μg／mL LH的OMⅢ成熟率54.6%，與對照組差異顯著（P＜0.05）（表1）。OMⅡ的成熟率與OMⅠ和OMⅢ的成熟率差異顯著（P＜0.05）。該結(jié)果說明，成熟液中適度FSH和LH的濃度變化對灘羊卵母細胞體外成熟有著非常重要的影響，過高的激素濃度對卵母細胞的成熟有抑制作用。

圖1 FSH與LH對灘羊卵丘－卵母細胞復合體擴散度的影響（40×）Fig.1 The effects of FSH and LH on Tan sheep cumulus－oocyte complexes in vitro（40×）

圖2 不同F(xiàn)SH和LH激素濃度卵母細胞的擴散距離（擴散直徑對應(yīng)圖1次序）Fig.2 The oocyte diffusion distance（Diffusion diameter corresponding figure 1order）in different FSH and LH concentrations

2.2 添加HMG時卵母細胞體外成熟結(jié)果

在卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液中添加HMG（FSH∶LH≈1∶1）可替代FSH和LH激素的添加，不同HMG濃度也可促進COCs的擴散（圖3），在培養(yǎng)22h后卵丘細胞擴散直徑表現(xiàn)為對照組（圖3A）＜OM Ⅳ（圖3B）＜OM Ⅴ（圖3C）＜OM Ⅵ（圖3D）＜OMⅦ（圖3E）。隨著激素濃度增加擴散直徑也在增加，但當濃度大于0.2IU／mL濃度時擴散度不再增加。同樣運用ImageJ2x軟件測定各組成熟液中的卵母細胞擴增距離顯示，不加激素的對照組與添加激素的OM Ⅳ、OM Ⅴ、OM Ⅵ、OMⅦ各組中卵母細胞的擴增距離差異顯著（P＜0.05）。添加激素的各組之間差異不顯著（P＞0.05）。如圖4顯示（擴散直徑對應(yīng)圖3次序）。

表1 不同F(xiàn)SH和LH濃度對灘羊卵母細胞體外成熟的影響Table1 The effects of FSH and LH concentration on in vitro maturation of tan sheep oocytes

在成熟培養(yǎng)液中添加不同濃度的HMG，卵母細胞的成熟率不同（表2）。其中添加0.1IU／mL HMG的成熟液的成熟率為69.6%，與對照組差異顯著（P＜0.05）。這表明0.1IU／mL HMG添加培養(yǎng)液中有利于卵母細胞的成熟。

圖3 HMG對卵丘－卵母細胞復合體（COCs）擴散的影響（40×）Fig.3 The effects of HMG on Tan sheep oocyte maturation in vitro（40×）

圖4 不同HMG激素濃度卵母細胞的擴散距離（擴散直徑對應(yīng)圖3次序）Fig.4 The oocyte diffusion distance in different HMG hormone concentrations（Diffusion diameter corresponding figure 3order）

表2 HMG濃度對灘羊卵母細胞體外成熟的影響Table2 The effects of HMG concentration on in vitro maturation of Tan sheep oocytes

3 討論

哺乳動物卵母細胞體外成熟培養(yǎng)技術(shù)是利用類固醇激素和促性腺激素在體外模擬卵泡的環(huán)境，進而誘發(fā)卵母細胞成熟的一項試驗研究。在卵母細胞成熟過程中，促卵泡素FSH和出黃體素LH等促性腺激素素具有協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)卵母細胞成熟。研究表明，F(xiàn)SH能顯著提高體外成熟卵母細胞的體外受精能力及早期胚胎的發(fā)育能力，其中FSH與誘導卵丘擴散、暫時抑制GVBD，改變了第一次減數(shù)分裂所需的時間，從而促進了卵母細胞的成熟。LH也有類似作用，另一方面通過除去成熟分裂抑制因子而對卵母細胞發(fā)揮作用[6]。

FSH在卵泡發(fā)育中起至關(guān)重要的作用，它通過cAMP途徑促進卵丘細胞增生并產(chǎn)生相應(yīng)的LH受體[7]促使卵丘細胞膨散，通過刺激顆粒細胞分泌成熟促進物，直接或間接地作用于卵母細胞，啟動卵母細胞成熟分裂[8]，將FSH加入培養(yǎng)基中促進人卵母細胞體外成熟，獲81%的成熟率[9]。對于LH，一般認為通過兩條途徑發(fā)揮作用：一是引起卵丘發(fā)生變化，促進卵丘細胞擴散，可以促進顆粒細胞上孕酮受體的表達及孕酮的產(chǎn)生，孕酮通過Connexin 43導致GVBD便于精子通過卵丘細胞間隙到達透明帶[10]；二是顯著增強了卵母細胞的存活力，降低異常卵母細胞的數(shù)量，從而提高卵母細胞的受精率[11]。

即使同一種動物，在卵母細胞體外成熟中，所添加FSH和LH劑量的報道也不盡相同。如在綿羊，Obrien J K 等[12]添加 FSH／LH 的量為10μg／mL，Andrew等的添加量為5μg／mL，Daniel等的添加量為LH 10μg／mL，F(xiàn)SH 1μg／mL。本試驗結(jié)果表明在成熟液中添加激素FSH和LH可以獲得不同的卵母細胞成熟率（68.8%～54.6%），在 FSH／LH 小于200μg／40μg／mL，隨著激素濃度增加成熟率呈濃度正相關(guān)。但當激素濃度大于300μg／60μg／mL，表現(xiàn)出對卵母細胞成熟的抑制作用。同樣，添加HMG單位濃度在小于0.1IU／mL時，卵母細胞的成熟率表現(xiàn)為正相關(guān)，但當其濃度大于0.1IU／mL下，卵母細胞的成熟表現(xiàn)為抑制作用，這與敖紅等[13]在綿羊上的研究結(jié)果相似。HMG含有1∶1（U）的FSH和LH，可用來代替FSH和LH用于山羊和牛卵母細胞的成熟培養(yǎng)[14]。本研究比較了FSH和LH配合使用或HMG單獨使用時對灘羊卵母細胞體外成熟的影響。結(jié)果表明，200μg／mL FSH和40μg／mL LH配合使用對卵母細胞的成熟的效果稍差于0.1IU／mL HMG添加效果，這與賽務(wù)家甫的研究結(jié)果略有不同[15]，推斷差異可能是由于激素的不同生產(chǎn)廠家造成的。

綜上所述，在卵母細胞體外成熟中，添加200μg／mL FSH和40μg／mL LH與或添加0.1IU／mL HMG的成熟培養(yǎng)體系在灘羊卵母細胞體外成熟中效果良好，為進一步進行灘羊卵母細胞的應(yīng)用試驗奠定了基礎(chǔ)。

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