奚建,李建利
痹痛貼是由獨(dú)活、川芎、肉桂、乳香、沒(méi)藥等藥材經(jīng)過(guò)提取、濃縮、成型等步驟制備的貼劑,具有活血化瘀,消腫止痛的功效,用于治療各種痹癥。方中獨(dú)活為君藥,其發(fā)揮鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和抗炎、解痙、抗血栓作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)主要為香豆素類化合物,川芎、肉桂等藥材主含揮發(fā)油;乳香、沒(méi)藥[1]中發(fā)揮鎮(zhèn)痛、抑制炎癥、抗血栓等作用的物質(zhì)基礎(chǔ)主要為樹脂成分。故筆者擬定了對(duì)方中川芎、肉桂等藥材先提取揮發(fā)油,提揮發(fā)油后的藥渣再與剩余藥材乙醇回流提取的工藝。由于傳統(tǒng)用藥都是水煎,故提取揮發(fā)油所得水提取液也應(yīng)作為處方藥效成分,但由于水煎液多含有蛋白質(zhì)、多糖、淀粉、黏液質(zhì)等雜質(zhì),使藥效成分含量降低,影響療效;故本文主要對(duì)按試驗(yàn)優(yōu)選出的最佳提取揮發(fā)油工藝后的水煎液進(jìn)行除雜研究,采用乙醇沉淀法,以藥液比、含乙醇量為考察因素,以醇浸膏收率和阿魏酸的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo),通過(guò)正交設(shè)計(jì)表來(lái)安排實(shí)驗(yàn),來(lái)優(yōu)化最佳工藝。
川芎、肉桂等藥材購(gòu)自四川科倫天然藥業(yè)有限公司,經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)盧先明教授鑒定,藥材符合《中國(guó)藥典》2010年版要求[2],阿魏酸對(duì)照品(批號(hào)110773-200611)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所),甲醇為色譜純,純凈水(哇哈哈純凈水),其余所用試劑均為分析純。
島津LC-20AT型高效液相色譜儀(SPD-20A 紫外檢測(cè)器);METTLER TOLEDO電子天平(AB204-E)。
2.1.1 色譜條件[2]色譜柱Kromasil C18(5μm,250×4.6mm);流動(dòng)相甲醇-0.1%醋酸水(35:65);流速1.0 mL.min-1;柱溫30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm。
2.1.2 方法專屬性考察 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蛇床子素對(duì)照品適量,用甲醇溶解制成15μg/ml的溶液即得。
供試品溶液的制備 分別精密吸取各樣品提取溶液5ml,揮干,用甲醇溶解,并定容至25ml容量瓶,取溶液適量微孔濾膜(0.45 μm)過(guò)濾,即得。
方法專屬性 分別精密吸取蛇床子素對(duì)照品溶液,供試品溶液各15μL,分別注入液相色譜檢測(cè),阿魏酸對(duì)照品,供試品在9.5min左右出現(xiàn)阿魏酸吸收峰。
2.1.3 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品(15μg/ml)溶液2、4、8、10、16μl,按上述色譜條件注入液相色譜儀,測(cè)定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo),相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo),計(jì)算回歸方程為:Y=1E+06X-272621(r=0.9997)。結(jié)果表明阿魏酸在0.03~0.24μg之間有良好的線性關(guān)系。
2.1.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取阿魏酸對(duì)照品溶液,重復(fù)進(jìn)樣5次,以蛇床子素峰面積計(jì)算,RSD為0.86%。
2.1.5 穩(wěn)定性考察 精密吸取同一供試品5μL,分別在0,2,4,6,8,10 h測(cè)定峰面積,RSD為1.20%(n=6),表明供試品在10 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.1.6 阿魏酸含量測(cè)定 分別取“2.2”項(xiàng)下得到的9組供試品溶液,0.45μm微孔濾膜過(guò)濾,各精密吸取15μl,分別進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,計(jì)算阿魏酸的含量。結(jié)果見表2。
影響醇沉除雜效果的因素有藥液含醇濃度,初始藥液質(zhì)量濃度和靜置時(shí)間、醇沉次數(shù)等,參考相關(guān)文獻(xiàn)[3]并結(jié)合預(yù)試驗(yàn),并考慮到痹痛貼的提取工藝線路,選擇藥液含醇濃度和初始藥液質(zhì)量濃度為考察因素,并考慮兩因素交互作用,按表2進(jìn)行正交試驗(yàn),以浸膏收率和阿魏酸的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)。按L9(34)正交表進(jìn)行設(shè)計(jì)。因素水平見表1。
表1 因素水平表
將提揮發(fā)油水煎液濃縮至一定的質(zhì)量濃度,加入95%乙醇使藥液中乙醇達(dá)到一定濃度值,冷藏24小時(shí),抽濾,濾液回收乙醇后定容至100mL,即得得1~9號(hào)樣品溶液,測(cè)定含量。分別吸取定容后的樣品溶液20 mL,置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中,水浴蒸干,于105℃干燥3 h,置干燥器中冷卻30 min,取出,迅速稱量,計(jì)算浸出物得率。結(jié)果見表2。
浸出物得率=醇沉后浸膏質(zhì)量/初始浸膏質(zhì)量×100%
表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及計(jì)算表
表3 醇浸膏方差分析
表4 阿魏酸含量方差分析
以浸膏得率為考察指標(biāo),各因素作用主次為B>A,方差分析表明B因素有顯著性影響,A×B無(wú)顯著性影響,說(shuō)明A與B無(wú)交互作用,醇沉后浸膏率以少為宜,故以A1B3為佳。以阿魏酸含量為考察指標(biāo),各因素作用主次為A>B,方差分析表明均無(wú)顯著性影響,以A1B2為佳。考慮到阿魏酸含量的重要性,故最后選擇A1B2,即初始藥液質(zhì)量濃度為1.0~1.10g/ml,加95%乙醇醇沉,使含醇量達(dá)70%。
按確定的除雜工藝進(jìn)行平行3次驗(yàn)證試驗(yàn),結(jié)果3次試驗(yàn)浸膏得率分別為14.08%,14.13%,14.16%,平均值為14.12%;阿魏酸含量分別為2.03,2.32,2.45mg,平均值為2.27mg。表明該提取工藝穩(wěn)定、可行。
本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選的痹痛貼水提取液最佳醇沉工藝為初始藥液質(zhì)量濃度為1,加95%乙醇醇沉,使含醇量達(dá)70%,在此工藝條件下, 阿魏酸的含量較高和浸出物得率適中;對(duì)于影響乙醇醇沉的因素中,初始質(zhì)量濃度過(guò)高的藥液黏稠度高, 難以與乙醇充分接觸,析出的沉淀易包裹藥液而造成有效成分損失;初始質(zhì)量濃度過(guò)低則藥液量大, 耗費(fèi)乙醇, 延長(zhǎng)時(shí)間。因此選擇了1.0~1.10g/ml,1.10~1.15g/ml,1.15~1.20g/ml三個(gè)范圍的初始質(zhì)量濃度為考察指標(biāo);對(duì)于藥液含醇濃度,濃度太低,乙醇用量大浪費(fèi),回收不方便,且沉淀成絮狀,難以下沉,效果差;濃度太高,得到的醇提液較少,沉淀中含有大量的有效物質(zhì),且加入高濃度乙醇,易造成局部濃度過(guò)高,形成大塊沉淀,將有效成分包裹,隨沉淀除去,并參考相關(guān)文獻(xiàn)[3],選擇藥液含醇量分別為50%、60%、70%三個(gè)水平考察對(duì)所測(cè)指標(biāo)的影響。另外預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)醇沉次數(shù)的研究表明,醇沉次數(shù)并無(wú)顯著影響,且從簡(jiǎn)化工藝、節(jié)約生產(chǎn)成本選擇醇沉一次。
[1] 徐艷.乳香、沒(méi)藥的炮制使用[J].安徽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2004,10(5):317.
[2] 中國(guó)藥典.一部[S].2010:38,127.
[3] 玄律,倪健.多指標(biāo)優(yōu)選醒目顆粒水提醇沉制備工藝[J].中成藥雜志,2010,32(7):1238.