柳淑婧,周大利,劉丹平,張翔,龍沁,陳冬林
(1.四川大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,成都 610064;2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨科,遼寧 錦州 121001)
關(guān)節(jié)軟骨是人體骨骼的重要連接部位。因創(chuàng)傷、炎癥、退變、腫瘤切除等原因?qū)е碌年P(guān)節(jié)軟骨損傷和缺損在臨床上極為常見,而關(guān)節(jié)軟骨再生及修復(fù)能力極為有限,一旦損傷后,難以自身修復(fù)。采用人工軟骨替代材料修復(fù)初期大面積軟骨病變和損傷是一種必不可少的治療手段[1-2]。
聚乙烯醇水凝膠(polyvinylalcohol hydrogel,PVA),由于其無(wú)毒、性質(zhì)穩(wěn)定、優(yōu)良的力學(xué)性能及親水性而廣泛用于食品工業(yè)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,已獲美國(guó)FDA 批準(zhǔn)[3]。在醫(yī)學(xué)上,主要用于人工軟骨材料、藥物載體、眼科材料、人工細(xì)胞微囊化、抗凝血材料、生物醫(yī)用海綿等方面。PVA 水凝膠具有類似天然軟骨的多微孔組織,內(nèi)含大量的水,是一種可滲透材料。在載荷作用下,液體可以滲入和擠出,起到潤(rùn)滑作用,大大降低對(duì)磨表面的摩擦阻力,避免由于磨損造成的植入體短期失效和磨屑引起的并發(fā)癥[4]。另外,PVA 水凝膠的高含水性及其特殊的表面結(jié)構(gòu)和天然軟骨組織非常相似,因而PVA 水凝膠是首選的人工軟骨材料之一[5-8]。殼聚糖((C6H11NO4)n,CS)無(wú)溶血效應(yīng)、無(wú)毒、無(wú)刺激性、無(wú)致敏性、無(wú)致突變作用,具有良好的生物相容性、生物可降解性及促進(jìn)藥物吸收的作用[9-11]。
本研究采用乳化發(fā)泡—冷凍冰晶相分離—去除表面活性劑的方法制備了PVA/CS 復(fù)合物多孔材料,所選用乳化劑為致孔效果好而毒性低的中性表面活性劑聚山梨酯-80(Tween-80),并對(duì)多孔PVA/CS 復(fù)合物的制備、性能及細(xì)胞相容性做了初步研究。
1.1 主要試劑與儀器 (1)試劑:聚乙烯醇(PVA-1799);殼聚糖;聚山梨酯-80;冰醋酸;上述試劑均為分析純。PBS 緩沖液;培養(yǎng)基(DMEM,高糖型); (2)儀器:DF-101s 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器;LGJ-12 冷凍干燥機(jī);C02孵箱(HARRIS);
1.2 樣品的制備 (1)PVA/CS 復(fù)合水凝膠的制備 采用溶液共混法制備PVA/CS 復(fù)合水凝膠。稱取一定量的PVA 于蒸餾水中,于90 ℃恒溫水浴箱中攪拌3 h,使其充分溶解,配制成一定濃度的PVA 水溶液。稱取一定量的CS置于潔凈燒杯中,按CS 質(zhì)量與1wt%的乙酸溶液體積比(w/v)為1∶50 加入乙酸溶液,充分?jǐn)嚢枞芙夂?,緩慢加入至PVA 水溶液,磁力攪拌30 min。然后將混合均勻的CS/PVA 水溶液放入真空干燥箱中30 min 抽真空消泡,之后迅速倒入模具(24 孔板)中并在冷凍干燥箱中冷凍成型,冷凍溫度為-20 ℃,冷凍時(shí)間為20 h,取出試樣后室溫下融化4 h,上述冷凍一解凍過(guò)程重復(fù)7 次制得PVA/CS 水凝膠。樣品取出后立即放入1%NaOH 溶液中浸泡處理6 h 以中和乙酸,再放入PBS 緩沖液中48 h 調(diào)整pH 值至中性,最后放入蒸餾水中保存。各不同PVA:CS 配比(w/w)的PVA/CS 復(fù)合水凝膠樣品編號(hào)見表1;(2)PVA/CS 多孔水凝膠的制備 采用乳化發(fā)泡—冷凍冰晶相分離一去除表面活性劑法制備PVA/CS 多孔水凝膠。按(1)中制得PVA/CS 混合溶液后,取30 g 該混合水溶液加入2 g 表面活性劑Tween-80,以800 r/min 攪拌30 min,迅速倒入模具中,然后進(jìn)行與(1)中相同的冷凍—解凍過(guò)程處理,并做相同的PBS 浸泡處理,最后用蒸餾水浸泡7 d (每天換水)以除去表面活性劑。各不同PVA:CS 配比(w/w)的PVA/CS多孔水凝膠樣品編號(hào)見表1。
表1 原料的配比及樣品編號(hào)
后面的圖表中出現(xiàn)的圖標(biāo)除特別注明外,a、b、c、d 及a (T)、b (T)、c (T)、d (T)均為表1 所示樣品編號(hào)。
1.3 樣品的性能測(cè)試
1.3.1 含水率的測(cè)定 將凝膠試樣用濾紙擦干表面的水份后稱重,得凝膠試樣的重量W1;然后將凝膠試樣真空干燥后稱重,得干樣的重量W2,用下式進(jìn)行計(jì)算:
1.3.2 干膠溶脹性能的測(cè)定 將干燥后的凝膠準(zhǔn)確稱重,記為W0。在室溫下將干凝膠放入去離子水中,分別浸泡24,48,72,96,120 h 后取出,用濾紙小心吸干表面附著的水分后稱重。用Wt 表示t 時(shí)刻凝膠的質(zhì)量,水凝膠的t時(shí)刻的溶脹度(SRt)可由下式進(jìn)行計(jì)算:
1.3.3 紅外光譜儀(IR) 將試樣真空干燥后,用紅外光譜儀對(duì)復(fù)合材料的基團(tuán)結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)試分析(400~4000 cm-1)。
1.3.4 差示掃描量熱分析(DSC)測(cè)試 用差示掃描量熱儀研究真空干燥后的復(fù)合材料中PVA 的熱行為。分析樣品量為5~10 mg,升/降溫速度10 ℃/min,樣品池N2氣氛,測(cè)試范圍25~250 ℃。
1.3.5 掃描電鏡(SEM)觀察 冷凍干燥48 h 后用掃描電鏡對(duì)復(fù)合材料形貌進(jìn)行觀察。
1.4 材料的細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)
1.4.1 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖率與活性 浸提液的制備:將材料用Co60輻照消毒(25kGy)滅菌后,按照標(biāo)本的表面積:液體培養(yǎng)基的體積=1 cm2:10 mL 的比例浸入含10%血清的細(xì)胞培養(yǎng)液,置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下48 h,用0.22 μm 濾膜過(guò)濾除菌后,制備成浸提液[12]。
MTT 檢測(cè):于加入細(xì)胞后的第1、3、5、7 d 進(jìn)行MTT檢測(cè),檢測(cè)時(shí)每孔加入5 mg/mL 的MTT [溴化-3- (4,5-二甲基噻唑基-2)2,5-二苯基四唑鹽]20 μL,4 h 后棄上清,每孔加DMSO 50 μL 并振蕩,10 min 后去掉材料在連續(xù)光譜測(cè)讀儀上檢測(cè)吸光度A 值,檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm,計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率(relative growth rate,RGR),按ISO 和醫(yī)學(xué)生物材料標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定材料毒性[13],具體計(jì)算方法、評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如下:細(xì)胞增殖率RGR (%) = (實(shí)驗(yàn)組A 值/細(xì)胞對(duì)照組A 值) ×100%,參照《美國(guó)藥典》毒性分級(jí)法[14]評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性。0 級(jí)、1 級(jí)為沒有細(xì)胞毒性;2 級(jí)為輕度細(xì)胞毒性;3 級(jí)和4 級(jí)為中度細(xì)胞毒性;5 級(jí)為明顯細(xì)胞毒性。
1.4.2 MG63 細(xì)胞與材料的復(fù)合培養(yǎng) 細(xì)胞懸液的制備:取生長(zhǎng)穩(wěn)定的MG63 細(xì)胞,經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%的胰酶消化后用全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù),用DMEM 配制2 ×104個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液。
細(xì)胞與材料的復(fù)合培養(yǎng):取制備好的細(xì)胞懸液,分別接種于已準(zhǔn)備好的材料上,在37 ℃,體積分?jǐn)?shù)5%的CO2孵箱繼續(xù)靜置培養(yǎng)5 d (每天更換培養(yǎng)基)。分別于4 h,1 d,3 d,5 d 將試樣取出,以體積分?jǐn)?shù)10%的多聚甲醛固定,體積分?jǐn)?shù)30%~100%的乙醇梯度脫水,醋酸異戊酯置換乙醇,臨界點(diǎn)干燥,表面噴金,SEM 下觀察。
2.1 樣品的性能測(cè)試結(jié)果及討論
2.1.1 含水率(Cw) 每種樣品隨機(jī)取3個(gè)3 g 左右的試樣進(jìn)行含水率的測(cè)定,結(jié)果如圖1 所示。關(guān)節(jié)軟骨中固態(tài)物質(zhì)占20%~40%,水占60%~80%[15],本研究中制得的復(fù)合水凝膠的高含水性與天然軟骨組織比較相似。且隨著PVA含量的增加,含水率逐漸增加。而采用加入乳化劑制備后,不同PVA/CS 質(zhì)量比樣品的含水率均有所下降。由此可調(diào)節(jié)PVA 與CS 的質(zhì)量比,得到不同含水量的復(fù)合水凝膠。
2.1.2 溶脹性能 圖2 是不同配比的凝膠在室溫下的溶脹曲線。從圖2 中可以看出,未加入乳化劑處理時(shí),隨著PVA 含量增加,凝膠的吸水能力增強(qiáng),這是由于PVA 分子具有很好的親水性,增加了凝膠的吸水性。加入乳化劑制備后,吸水能力與同配比不加乳化劑的材料相比更強(qiáng),這是其多孔性所引起的。而不同材料表現(xiàn)出相似的吸水變化,即前72 h 吸水率變化大,72 h 后出現(xiàn)緩慢增加趨勢(shì),120 h時(shí)達(dá)到溶脹平衡。
2.1.3 紅外光譜分析(IR) 圖3 是純PVA 及CS 的紅外譜圖。圖4 為PVA/CS 復(fù)合水凝膠的紅外光譜圖。在PVA的紅外譜圖中,3400 cm-1屬于-OH 伸縮振動(dòng)吸收峰[16];1087 cm-1處的C-O 伸縮振動(dòng)峰、664 cm-1處的-OH 彎曲振動(dòng)峰為CS 的特征峰[17]。
圖4 表明,隨著PVA 的加入,CS 結(jié)晶敏感峰向高波數(shù)移動(dòng),在3447 cm-1處附近的-OH 伸縮峰也向高波數(shù)移動(dòng),這表明材料中CS 分子與PVA 分子有較強(qiáng)的氫鍵作用,對(duì)CS 的分子振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)產(chǎn)生影響。
2.1.4 差示掃描量熱(DSC) 圖5 是不同PVA/CS 質(zhì)量比樣品的DSC 曲線,圖中exo 箭頭示放熱方向。樣品a、b、c、d 的熔融峰依次為231.14、232.05、234.08、234.11℃。由此可看出,當(dāng)PVA 與CS 共混后,熔融峰歸結(jié)于PVA 的結(jié)晶熔融峰[18]。隨著PVA 與CS 質(zhì)量比增加,熔融溫度稍有升高,但不明顯。
2.1.5 掃描電鏡(SEM)觀察 圖6 為不同PVA/CS 質(zhì)量比樣品的SEM 照片。分析圖6 所示形成凝膠的孔洞結(jié)構(gòu)可發(fā)現(xiàn)隨著PVA 含量增加,孔徑略有變小。這主要是由于PVA 含量增加,PVA 和CS 分子之間纏繞加強(qiáng)。
圖7 為制備過(guò)程中加入乳化劑處理的樣品d (T)的SEM 照片。從圖7 可以看到加入乳化劑處理后,凝膠表面和內(nèi)部存在不同尺寸和形狀的孔洞和索狀結(jié)構(gòu),并有微孔在大孔周圍,且孔與孔之間貫通性好,為水凝膠提供了良好的可滲透性。
圖8 為未加入乳化劑處理樣品d 的SEM 照片。從圖8可看出材料仍有不同孔徑的孔洞,這是由于在水凝膠形成過(guò)程中水分子分布在PVA 和CS 交聯(lián)的網(wǎng)格中,當(dāng)用冷凍干燥法進(jìn)行制樣時(shí)冰晶溶解,在原有的位置上就會(huì)留下孔隙。但此時(shí)部分孔洞封閉或形狀塌陷,貫通性較差,孔隙率低于加入乳化劑處理的材料。圖6、7、8SEM 照片清楚地反映出PVA 與CS 相容性好,無(wú)相分離,其PVA/CS 質(zhì)量比對(duì)水凝膠結(jié)構(gòu)有一定影響。
2.2 材料的細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論
2.2.1 MTT 法檢測(cè)結(jié)果及討論 采用MTT 法檢測(cè),由表2~3 表明:(1)經(jīng)5 d 的復(fù)合培養(yǎng)后,細(xì)胞在各種PVA/CS質(zhì)量比樣品上都呈現(xiàn)出良好的粘附和增殖行為,具有較好的細(xì)胞相容性。但所有實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較隨時(shí)間延長(zhǎng)吸光度A 值、相對(duì)增殖率呈現(xiàn)一定降低趨勢(shì)。(2)相同PVA/CS 質(zhì)量比的材料相比較,加入乳化劑處理的實(shí)驗(yàn)組隨時(shí)間延長(zhǎng)吸光度A 值、相對(duì)增殖率較未加入乳化劑組稍低,但細(xì)胞毒性均不明顯。
各實(shí)驗(yàn)組毒性在0~2 級(jí),表明不同組分的復(fù)合材料毒性均較低。
2.2.2 MG63 細(xì)胞與材料的復(fù)合培養(yǎng)結(jié)果及討論 圖9 為MG63 細(xì)胞與經(jīng)乳化劑處理制備的PVA/CS 多孔水凝膠復(fù)合培養(yǎng)后的SEM 照片。復(fù)合培后4 h 后的SEM 照片顯示材料上的細(xì)胞多為圓形,且無(wú)明顯分泌顆粒;24 h 后,材料上的細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,呈扁平或梭形,一些已經(jīng)鋪展開,有少量分泌物;72 h 后,細(xì)胞形態(tài)變扁并鋪展開,細(xì)胞表面出現(xiàn)較多分泌顆粒,并開始出現(xiàn)偽足黏附于材料上;120 h 后,分泌顆粒進(jìn)一步增多且偽足增多,緊密黏附于材料上。而材料中PVA 與CS 質(zhì)量比不同,細(xì)胞生長(zhǎng)情況并無(wú)明顯不同。
圖10 為未加入乳化劑處理的PVA/CS 復(fù)合水凝膠與細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)72、120 h 后的SEM 照片。由圖10 可見細(xì)胞在材料表面及孔洞附近生長(zhǎng)情況良好,且有在孔洞附近聚集生長(zhǎng)的趨勢(shì),細(xì)胞密度較加入乳化劑處理制備的PVA/CS多孔水凝膠小。PVA 與CS 配比不同未觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)情況有明顯不同。
表2 不同材料的MTT 檢測(cè)結(jié)果
表3 不同材料的細(xì)胞增殖率與毒性分級(jí)
采用PVA 和CS 作為原料,Tween-80 作為乳化劑,通過(guò)乳化發(fā)泡-冷凍冰晶相分離-去除表面活性劑法制備了不同PVA 與CS 配比的PVA/CS 多孔水凝膠,該法簡(jiǎn)單易行,所制備水凝膠具有良好細(xì)胞相容性。與未加乳化劑制備的PVA/CS 復(fù)合水凝膠相比,采用乳化劑制備的PVA/CS多孔水凝膠孔洞相互貫通,孔隙率較高,可提高細(xì)胞黏附性。同時(shí)采用乳化劑制備PVA/CS 多孔水凝膠時(shí),PVA 與CS 質(zhì)量比不同對(duì)材料對(duì)孔徑大小有影響,由此可通過(guò)調(diào)節(jié)PVA 與CS 質(zhì)量比制得不同孔徑的材料。復(fù)合水凝膠的高含水性與天然軟骨組織比較相似,是一種潛在的軟骨修復(fù)與替代材料。
圖1 不同PVA/CS 質(zhì)量比樣品的含水率(Cw)
圖2 不同PVA/CS 質(zhì)量比樣品的溶脹率(SR)
圖3 PVA,CS 圖譜(a)PVA(b)CS
圖4 不同PVA/CS 質(zhì)量比樣品的IR 圖譜
圖5 不同質(zhì)量比樣品的DSC 曲線
圖6 不同PVA/CS 質(zhì)量比的形貌(不含乳化劑)
圖7 SEM 不同倍數(shù)下材料表面/斷面孔隙的形貌(樣品d(T))
圖8 未加入乳化劑的PVA/CS 材料形貌圖(樣品d)
圖9 細(xì)胞與加入乳化劑制備樣品復(fù)合培養(yǎng)SEM 圖
圖10 細(xì)胞與未加入乳化劑處理樣品復(fù)合培養(yǎng)SEM 圖
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