戈麗薇，王月，高志安

(遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121000)

在女性惡性腫瘤中，宮頸癌已經(jīng)成為危害全球婦女健康的主要?dú)⑹?，其發(fā)病率和病死率僅次于乳腺癌，位居世界水平第二位。因此，提高宮頸癌患者的早期診斷、預(yù)后判斷和治療的準(zhǔn)確性，是目前婦科臨床工作的重點(diǎn)和難點(diǎn)。1992 年WHO 宣布人乳頭瘤病毒(HPV)是引起宮頸癌的首要因素，然而大量臨床病例也證實(shí)并非全部HPV 感染者都會發(fā)展成為宮頸上皮內(nèi)瘤變或者宮頸癌。其中僅有少數(shù)會發(fā)生上皮內(nèi)瘤變;發(fā)展到宮頸癌的則更少。不僅如此，宮頸癌的發(fā)病年齡高峰遠(yuǎn)遲于HPV 感染者年齡高峰。因此，在HPV 感染的基礎(chǔ)之上，宮頸癌的發(fā)生仍然具有選擇性。宮頸癌的發(fā)生還會有一些因素與HPV 感染起到協(xié)同作用。脆性組氨酸三聯(lián)體基因(Fragile histidine triad，F(xiàn)HIT)是ohta 等［1］在1996 年利用定位克隆技術(shù)及外顯子捕獲法，在染色體3p 區(qū)域找到一個新的抑癌基因。該基因覆蓋染色體3p 上的脆性位點(diǎn)FRA3B，腎細(xì)胞癌相關(guān)性斷裂點(diǎn)t (3;8)以及HPV16 整合位點(diǎn)，位于染色體3p14.2 區(qū)域，F(xiàn)HIT 基因在眾多的人類腫瘤組織和細(xì)胞系中，F(xiàn)HIT 表現(xiàn)為高頻缺失或者異常轉(zhuǎn)錄，其作用途徑可能是參與DNA 的修復(fù)、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控。一些學(xué)者，如Hendricks［2］Greenspan［3］以及Wistuba［4］等研究預(yù)測FHIT 基因缺失或者異常轉(zhuǎn)錄與HPV 感染可能對宮頸癌發(fā)生起協(xié)同作用的，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明FHIT 基因與致瘤型HPV 感染有著明顯的相關(guān)性。然而也有一些學(xué)者在研究中并沒有發(fā)現(xiàn)HPV 感染狀態(tài)與FHIT 基因異常之間存在明顯相關(guān)性。因此，宮頸癌中HPV 感染與FHIT 基因異常之間的相關(guān)情況，目前并沒有一致性意見。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法以及原位雜交法分別檢測宮頸癌及其癌前病變組織中FHIT 蛋白和HPV16/18 DNA表達(dá)情況及其相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 10 例正常宮頸組織，39 例上皮內(nèi)瘤變(cervical intraep ithelial neoplasia，CIN)，50例原發(fā)性浸潤性宮頸鱗癌(invasive cervical neoplasia，ICC)病例全部選自遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理科存檔的2009 年1 月至2011 年12 月的石蠟標(biāo)本。其中，ICC 病例全部是資料完整、術(shù)前未經(jīng)治療的病例?；颊吣挲g32～65 歲，平均年齡46.8 歲。CIN 各級均選取10 例，對照組為因子宮肌瘤等行子宮全切術(shù)，術(shù)后病理證實(shí)為正常宮頸者。

1.1.2 主要試劑 兔抗人FHIT 多克隆抗體、檸檬酸抗原修復(fù)液(0.01 M，pH6.0)、濃縮型DAB試劑盒、S－P 染色試劑盒、磷酸鹽緩沖液(0.01 M，pH7.2～7.4)、HPV16/18 原位雜交檢測試劑盒等試劑均購自北京中杉金橋生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)檢測 以PBS 代替一抗為陰性對照，以已知蛋白表達(dá)陽性的組織作為陽性對照。

1.2.2 原位雜交法 以PBS 代替HPV16/18DNA探針作為陰性對照，以已知正常宮頸組織作為陽性對照。

1.2.3 免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒要求操作 原位雜交步驟如下:原位雜交試劑盒為北京中杉金橋有限公司產(chǎn)品。切片常規(guī)脫蠟，乙醇逐級脫水干燥，PBS 緩沖液沖洗;胃酶37 ℃孵育30 min，PBS 沖洗3 次，每次3 min;加DNA 探針，加蓋玻片，95 ℃變性5 min，37 ℃雜交12 h，PBS 緩沖液浸泡10 min，去蓋玻片;除外陽性對照，切片加雜交后洗液，37 ℃孵育30 min，PBS 沖洗3 次，每次3 min;加辣根酶標(biāo)記抗地高辛抗體，37 ℃孵育30 min，PBS 沖洗，每次3 min;DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，乙醇逐級脫水后透明、封片。

1.3 結(jié)果判斷

1.3.1 免疫組化結(jié)果判定 FHIT 蛋白免疫組化染色陽性產(chǎn)物呈棕黃色顆粒，定位于細(xì)胞核中。按照Mattern 等提到的方法，從兩方面進(jìn)行半定量評分:(1)按染色細(xì)胞的百分比評分。未見染色細(xì)胞為0分，染色細(xì)胞＜25% 為1 分，染色細(xì)胞25%～50%為2 分，染色細(xì)胞＞50%為3 分; (2)按染色深淺度評分:無顯色為0 分，淺棕黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分;將這兩方面評分相加記總分(0～6 分)。每例評分均為高倍(400×)鏡下觀察10 個視野求得的平均分。評分1～2分為“+”，3～4 分為“+ +”，5～6 分為“+ ++”。＞2 分者為陽性表達(dá)，≦2 分者為陰性表達(dá)。

1.3.2 原位雜交結(jié)果判定 HPV 陽性病毒顆粒染成棕黃色于細(xì)胞核內(nèi)，連續(xù)觀察10 個高倍視野，計數(shù)細(xì)胞核呈棕黃色的陽性細(xì)胞，以陽性細(xì)胞數(shù)＞10%判斷為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS12.0 軟件，χ2檢驗(yàn)，Spearman 等級相關(guān)性分析進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析處理。

2 結(jié) 果

2.1 FHIT 蛋白表達(dá)、HPV16/18 DNA 在宮頸病變中的表達(dá) FHIT 蛋白定位于細(xì)胞核中，呈棕色或者棕黃色，彌漫性表達(dá)，尤其明顯見于上皮細(xì)胞。HPV16/18 DNA 也定位于細(xì)胞核中，F(xiàn)HIT 及HPV16/18 在各級組織中的表達(dá)情況見表Ⅰ。不同宮頸病變組織中組間兩兩比較見:FHIT 蛋白陽性表達(dá)正常組與CINⅠ之間沒有明顯的差異(P =0.481);正常組與CINⅡ～Ⅲ之間具有明顯差異(χ2=4.012，P=0.045);正常組與ICC 有明顯差異(χ2=18.989，P =0.000);CINⅠ與CINⅡ～Ⅲ組之間沒有明顯的差異(P =0.269);CINⅠ與ICC 之間有明顯的差異(χ2=13.630，P=0.000);CINⅡ～Ⅲ與ICC 有明顯差異(χ2=10.690，P =0.001)。HPV 病毒陽性表達(dá)率在不同宮頸病變組織中組間兩兩比較見:正常組織與CINⅠ之間沒有明顯的差異(P =0.096);正常組織與CINⅡ～Ⅲ之間有明顯的差異(χ2=4.012，P =0.045);正常組織與ICC 組間有明顯的差異(χ2=5.182，P=0.023);而宮頸病變各組間并無明顯差異(χ2=0.464，P=0.793)。

表1 不同宮頸組織中FHIT 蛋白、HPV16/18 DNA 表達(dá)

2.2 FHIT 蛋白表達(dá)與HPV16/18 DNA 檢測 宮頸病變組織中FHIT 蛋白與HPV16/18 病毒表達(dá)關(guān)系見表2。經(jīng)過Spearman 等級相關(guān)性分析，F(xiàn)HIT 蛋白表達(dá)與HPV16/18 病毒感染呈現(xiàn)明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系，隨著宮頸病變的不斷加深，在伴有HPV 陽性感染的情況下，F(xiàn)HIT 蛋白表達(dá)明顯減少(r =－0.446，P=0.006)。

表2 宮頸病變組織中FHIT 蛋白與HPV16/18 病毒表達(dá)關(guān)系

3 討 論

在1996 年FHIT 被發(fā)現(xiàn)以來，大量的研究發(fā)現(xiàn)FHIT 在正常上皮組織表現(xiàn)為強(qiáng)表達(dá)。而在大量上皮性腫瘤中卻存在著表達(dá)缺失或者是異常表達(dá)，尤其在與環(huán)境致癌因素關(guān)系密切的惡性腫瘤中存在明顯異常。FHIT 可能參與DNA 的修復(fù)、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控。在宮頸癌組織中，人們也進(jìn)行了大量的研究，F(xiàn)HIT 位于染色體3p14.2 區(qū)域，覆蓋染色體3p 上的脆性位點(diǎn)FRA3B，腎細(xì)胞癌相關(guān)性斷裂點(diǎn)t (3;8)以及 HPV16 整合位點(diǎn)。Hendricks等［2］2112－2115學(xué)者應(yīng)用RT－PCR 技術(shù)研究宮頸癌細(xì)胞，檢測到有63%的細(xì)胞系出現(xiàn)異常的FHIT 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，多為多個外顯子的缺失，mRNA 長度縮短。在其相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，在DNA 水平發(fā)現(xiàn)80%的異常細(xì)胞存在FHIT 結(jié)構(gòu)異常。Greenspan 等［3］4692－4698學(xué)者研究也顯示，高達(dá)6/7 宮頸癌細(xì)胞系和68%的原發(fā)宮頸癌檢測不到FHIT 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，亦或是檢測到異常產(chǎn)物，在免疫組化試驗(yàn)中也顯示出近有76%的原發(fā)癌FHIT 蛋白表達(dá)明顯缺失或減弱，蛋白表達(dá)與異常轉(zhuǎn)錄之間有很好的相關(guān)性。因此，F(xiàn)HIT 的異常表達(dá)在宮頸癌中是頻發(fā)事件，提示FHIT 基因改變是宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中的頻發(fā)事件。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果也表明，隨著正常宮頸組織－CIN 各級－宮頸癌的發(fā)展演變，F(xiàn)HIT 蛋白陽性表達(dá)率明顯降低。

引起皮膚粘膜的多種增生性病變，是一組具有高度特異性的嗜上皮性DNA 病毒。在宮頸癌病變的發(fā)生過程中，HPV 感染途徑開始于宮頸鱗狀上皮的基底層，通過損傷粘膜或微缺損進(jìn)入基底細(xì)胞。HPV DNA 在宿主細(xì)胞中常常以兩種狀態(tài)存在:在癌前期組織中，病毒常位于染色體之外，形成整合狀態(tài)。在癌細(xì)胞中，病毒DNA 則形成染色體外的附加體狀態(tài)，以單拷貝或多拷貝串聯(lián)方式整合于宿主細(xì)胞DNA 中，引起HPVE2 基因缺失。由于HPVE2 基因具有抑制HPVE6、E7 基因啟動的功能，從而導(dǎo)致E6、E7 基因表達(dá)異常，細(xì)胞生長失控。錢建華等通過對大量病例的研究認(rèn)為HPV 感染還存在著總感染率的地區(qū)、優(yōu)勢型別以及種屬的差異性，其中高危型HPV (HPV16/18 型等)感染是引發(fā)宮頸癌的重要原因之一。這在本實(shí)驗(yàn)資料中也顯示HPV16/18 DNA 陽性多見于CIN 各級及宮頸癌中。

Wistuba 等［4］3154通過對大量宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)瘤變病例的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HIT 基因的缺失不僅見于56%的浸潤癌，還見于20%的高級別CIN 中，并隨著級別的增高其缺失所占有的比例上升。張文淼等實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)FHIT 蛋白的表達(dá)情況在宮頸CIN 和宮頸癌中均有表達(dá)下降或者缺失情況的存在。他們還發(fā)現(xiàn)，HPV16 陽性的CIN 及宮頸浸潤癌病例中，65%存在FHIT 基因的雜合性缺失(Loss of Heter LOH)，同時有87%的FHIT 蛋白表達(dá)減弱或缺失的病例為HPV16 陽性，從而推測FHIT 基因表達(dá)與HPV16/18 感染之間具有一定相關(guān)性。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，經(jīng)過Spearman 等級相關(guān)性分析，F(xiàn)HIT 蛋白表達(dá)與HPV16/18 病毒感染呈現(xiàn)明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=－0.446，P=0.006)。

［1］Ohta M，Inoue H，Cotticelli MG，et al.The FHIT gene，spanning the chromosome3p14.2 fragile site and renal carcinomaassoc iated t (3;8)breakpoint，is abnormalin digestive tractcancers［J］.Cell，1996，84:587－597.

［2］Hendricks DT，Taylor R，Reed M，et al.FHITgene expression in human ovarian，endometrial，and cervical cancer cell lines［J］.Cancer Res，1997，57:2112－2115.

［3］Greenspan DL，Connolly DC，Wu R，et al.Loss of FHIT expression in cervical carcinoma cell lines and primary tumors［J］.Cancer Res，1997，57:4692－4698.

［4］Wistuba Ⅱ，Motellano FD，Milchgrub S et al.Deletions of chromosome 3p are frequent and darly events in the pathogenesis of uterine cervical caicinoma ［J］.Cancer Res，1997，57(15):3154