張鈦，劉義

(遼寧醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001)

糖尿病心血管病變是糖尿病對人最主要的危害，近年來在社會和醫(yī)藥界日益受到廣泛關(guān)注。眼底等小血管糖尿病病變早已受到重視，肢體血管、冠脈、腦血管等大、中血管并發(fā)癥已成糖尿病重要慢性并發(fā)癥之一，目前受到高度重視。隨著對糖尿病研究的深入，發(fā)現(xiàn)細胞凋亡在糖尿病的發(fā)生和發(fā)展過程中有重要的作用。通過藥物調(diào)節(jié)細胞凋亡，可阻止或延緩并發(fā)癥發(fā)生。

邱麗穎等［1－2］報道阿司匹林在大鼠腦缺血再灌注損傷時，通過提高Bcl－2 并降低Bax 基因蛋白表達，提高Bcl－2/Bax 比值而發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)，從而起到神經(jīng)保護作用。有研究報道阿司匹林發(fā)揮保護作用的有效劑量包括相當人常規(guī)使用的小劑量(日用100 mg)，而目前臨床糖尿病患者大多因合并或并發(fā)心腦血管疾病而長期服用小劑量阿司匹林，但糖尿病患者長期服用小劑量阿司匹林對主動脈細胞凋亡是否有影響?是否有主動脈保護作用?目前臨床觀察研究已有多篇報道［3－6］，尚缺乏較深入的實驗研究。我們采用大鼠尾靜脈注射鏈脲佐菌素造成I型糖尿病動物模型，研究小劑量阿司匹林對糖尿病大鼠主動脈顯微結(jié)構(gòu)和細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響，為小劑量阿司匹林可能會發(fā)揮保護糖尿病患者主動脈細胞凋亡及病理損傷提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 雄性SD 大鼠30 只，體重180～220 g，遼寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.2 主要藥物、試劑和器械 (1)拜阿司匹靈(阿司匹林腸溶片)，拜耳醫(yī)藥保健有限公司進口分裝，生產(chǎn)批號:BJ00557;(2)鏈脲佐菌素(STZ)，美國sigma 公司產(chǎn)品; (3)兔抗大鼠Bcl－2 抗體、Bax 單克隆抗體、二步法非免疫血清、生物素二抗及辣根酶標記的鏈酶親和素試劑盒(PV6001)、DAB 顯色試劑盒由中山杉生物技術(shù)公司提供，Caspase－3 單克隆抗體、生物素化二抗試劑盒(SP0023)美國sigma 購自北京博奧森公司產(chǎn)品; (4)DP72 型OLYMPUS 光學(xué)成像分析系統(tǒng)，日本奧林巴斯公司產(chǎn)品;(5)京都II 型血糖檢測儀，日本ARKRAY，Inc 株式會社產(chǎn)品。

1.3 動物分組與處理 30 只雄性SD 大鼠，隨機選取8 只作為正常對照組，22 只尾靜脈注射鏈脲佐菌素(STZ，30 mg/kg;1 g STZ 溶于100 mL 檸檬酸鹽緩沖液配制而成，pH4.5)，正常對照組大鼠注射同等體積的緩沖液。3 天后，禁食12 h，剪大鼠尾尖部，采用血糖儀現(xiàn)場測定血糖濃度，將血糖測定結(jié)果大于16.7 mmol/L 視為1 型糖尿病造模成功。隨機選取造模成功大鼠16 只，分為糖尿病模型組和9 mg/kg 阿司匹林 (ASA 組)治療組(按體表面積換算相當人日用100 mg)，每組8 只。ASA 組大鼠，拜阿司匹林片研碎后加適量蒸餾水，混勻后以0.1 mL/100 g 灌胃給藥12 w，正常對照組和糖尿病模型組大鼠同日灌服等量蒸餾水。實驗結(jié)束時，大鼠禁食12 h，5% 水合氯醛腹腔麻醉，打開腹腔，迅速取出主動脈，以冰鹽水沖洗，切取主動脈組織放入10% 中性甲醛內(nèi)，24 h 后石蠟包埋。

1.4 血液指標檢測 用血糖儀及專用血糖試紙現(xiàn)場檢測大鼠血糖。

1.5 HE 染色和免疫組化染色 石蠟包埋組織經(jīng)5 μm 系列切片后，常規(guī)行HE 染色后病理學(xué)觀察。

免疫組織化學(xué)染色:將組織石蠟包埋塊常規(guī)切片常規(guī)脫蠟至水，高壓修復(fù)抗原(將切片置于含pH 6.0 枸椽酸緩沖液的高壓鍋內(nèi)，加熱至減壓閥噴氣2 min，自然冷卻，取出，0.01 M PBS 洗滌3次，每次5 min);3% 過氧化氫溶液處理10～30 min 以去除內(nèi)源性過氧化物酶，0.01 M PBS 洗滌3次，每次5 min;滴加1:100 稀釋的滴加第一抗體(bcl－2、bax)，4 ℃過夜，0.1 M PBS 洗5 min×3次;滴加辣根酶標記羊抗兔 IgG 多聚體(PV6001)，37 ℃孵育30 min，0.01 M PBS 洗滌3次，每次5 min;滴加生物素化第二抗體，37 ℃20 min，0.1 M PBS 洗5 min×3 次;滴加辣根酶標記鏈霉親和素工作液，37 ℃20 min，0.1 M PBS洗5 min ×3 次;使用DAB 顯色試劑盒1 mL 蒸餾水加顯色劑A、B、C 各1 滴，混勻，加至標本上，顯色6 min，充分水洗;蘇木素復(fù)染細胞核1 min，充分水洗、1%鹽酸酒精分化、1% 胺水反藍、充分水洗、經(jīng)70%乙醇5 min、尿80%乙醇5 min、90%乙醇5 min 2 次、95%乙醇5 min 2 次、100%乙醇5 min 2 次，脫水、二甲苯透明5 min 2 次、中性樹脂封片。Caspase3 檢測:一抗洗滌后，滴加生物素化羊抗兔IgG (SP0023)，37 ℃孵育30 min，0.01 M PBS 洗滌3 次，每次5 min;滴加試劑SP，37 ℃孵育30 min，0.01 M PBS 洗滌3 次，每次5 min;DAB 顯色。其余步驟同上。結(jié)果觀察:用Olympus 成像分析系統(tǒng)高倍鏡(×400)下觀察和采集顯微圖像，采用美國顯微鏡圖像分析測量軟件Image－Pro Plus 6.0 測量平均累積光密度值(mean－IOD)，以黃色為陽性表達，分析Caspase－3、Bcl－2 和Bax 的表達情況。

2 結(jié) 果

2.1 小劑量阿司匹林對糖尿病大鼠主動脈顯微結(jié)構(gòu)的影響(圖1) 圖1 可見，糖尿病模型組大鼠主動脈顯微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)病理改變，血管壁肌間纖維排列紊亂，扭曲明顯;小劑量ASA 治療組出現(xiàn)上述病理改變明顯減輕，表明小劑量ASA 對糖尿病大鼠主動脈顯微結(jié)構(gòu)病理改變有保護作用。

2.2 小劑量阿司匹林對糖尿病大鼠主動脈凋亡相關(guān)蛋白表達的影響(圖2 和表1) 表1 和圖2 可見，正常對照組，主動脈平滑肌Caspase－3 和Bax呈弱表達，Bcl－2 表達較明顯;糖尿病模型組，主動脈平滑肌Caspase－3 和Bax 表達均明顯強于正常對照組，而Bcl－2 表達弱于正常對照組，Bcl－2/Bax 比值同時明顯低于正常對照組;小劑量ASA 治療組，主動脈平滑肌Caspase－3 和Bax 表達均明顯弱于糖尿病模型組，而Bcl－2 表達明顯強于糖尿病模型組和正常對照組，Bcl－2/Bax 比值同時明顯高于糖尿病模型組。

表1 小劑量阿司匹林(ASA)對糖尿病大鼠主動脈平滑肌凋亡相關(guān)蛋白表達(平均累積光密度值)的影響(，n=8)

3 討 論

凋亡過程的紊亂可能與許多疾病的發(fā)生有直接或間接地關(guān)系，在主動脈疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中同樣發(fā)揮著作用。近年來的大量研究表明，細胞凋亡受多基因嚴格控制的過程，這些基因包括Bcl－2家族、Bax 家族、Caspase 家族、癌基因如C－myc、抑癌基因P53等。細胞凋亡的過程大致可分為幾個階段:在接受凋亡信號后凋亡調(diào)控蛋白間發(fā)生相互作用，促使蛋白水解酶的活化(Caspase)，引起細胞膜、線粒體和染色體結(jié)構(gòu)改變等一系列連續(xù)反應(yīng)過程，導(dǎo)致細胞凋亡。Bcl－2 和Bax 蛋白就是一對重要的凋亡調(diào)控蛋白，它們分別與細胞凋亡呈負相關(guān)和正相關(guān)，Bcl－2/Bax 比值被許多學(xué)者作為評價凋亡調(diào)控的重要指標［7］。盡管直接判定凋亡細胞的指標則包括流式細胞檢查、Tunal 染色、凋亡小體及染色體檢查等，但蛋白水解酶(Caspase)的表達增強也可以作為啟動凋亡的重要標志。

我們實驗發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠主動脈Caspase－3和Bax 表達均明顯強于正常對照組，而Bcl－2 表達弱于正常對照組，Bcl－2/Bax 比值同時明顯低于正常對照組，這表明主動脈凋亡能力增強，凋亡啟動信號強烈。小劑量ASA 治療組，糖尿病大鼠主動脈Caspase－3 和Bax 表達均被對抗，尤其是Bcl－2 表達明顯增強，甚至明顯強于正常對照組，大幅提高Bcl－2/Bax 比值。這表明，小劑量阿司匹林可通過提高Bcl－2/Bax 比值，尤其是提高Bcl－2 表達，抑制糖尿病大鼠主動脈平滑肌細胞凋亡過程。我們發(fā)現(xiàn)小劑量阿司匹林抑制糖尿病大鼠主動脈細胞凋亡的同時，主動脈血管壁肌間纖維排列紊亂和扭曲等病理改變明顯減輕，但其意義尚不清楚。

阿司匹林對神經(jīng)系統(tǒng)缺氧/缺糖損傷已有多篇研究報道，其中抑制神經(jīng)細胞凋亡被認為是重要保護機制［8－10］。謝寶明等［11］采用流式細胞術(shù)檢測線粒體膜電位技術(shù)發(fā)現(xiàn)，阿司匹林對缺氧/缺糖的神經(jīng)元細胞線粒體膜電位具有一定的穩(wěn)定作用，并認為是抑制神經(jīng)元細胞凋亡的機制之一。

除凋亡機制外，目前已有國內(nèi)外學(xué)者提出阿司匹林對糖尿病大鼠主動脈的影響與調(diào)節(jié)COX－2 表達、炎癥因子等因素有關(guān)［12－13］。

圖1 大鼠主動脈HE 染色(×400)

圖2 大鼠主動脈免疫組織化學(xué)染色Caspase－3、Bax 和Bcl－2 (×400)

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