相 瑜，任麗平，王日昕

（浙江海洋學(xué)院海洋科學(xué)學(xué)院，浙江舟山 316022）

三疣梭子蟹Portunus trituberculatus，屬于軟甲綱、十足目、梭子蟹科，分布于日本、朝鮮、馬來群島、紅海以及中國的廣西、廣東、福建、浙江、山東半島、渤海灣、遼東半島等地，生活環(huán)境為海水，常生活于10～30 m的沙泥或沙質(zhì)海底。三疣梭子蟹肉多，脂膏肥滿，味鮮美，營養(yǎng)豐富。每百克蟹內(nèi)含蛋白質(zhì)14 g、脂肪2.6 g。鮮食以蒸食為主，還可鹽漬加工“槍蟹”、蟹醬，蟹卵經(jīng)漂洗曬干即成為“蟹籽”，均是海味品中之上品。

由于三疣梭子蟹具有生長快、環(huán)境適應(yīng)能力、強市場價格高和國內(nèi)外價格穩(wěn)定等特點使得各地三疣梭子蟹養(yǎng)殖不斷升溫，現(xiàn)已成繼對蝦、青蟹后又一重要養(yǎng)殖品種并被列為我國海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖的重點對象[1-4]，取得了良好的社會和經(jīng)濟效益。根據(jù)養(yǎng)殖設(shè)施的不同,梭子蟹養(yǎng)殖有池塘養(yǎng)殖、灘涂圍欄養(yǎng)殖、水泥池養(yǎng)殖和海區(qū)籠養(yǎng)等幾種方式。然而在養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)諸多病蟲害如病毒病、真菌餅、寄生蟲類病以及養(yǎng)殖環(huán)境的惡化引起的各種養(yǎng)殖問題，關(guān)于三疣梭子蟹的種質(zhì)資源分析與評估的研究已經(jīng)開展，這些研究將為篩選及培育具有優(yōu)勢生長性狀、抗病能力強、抗性良好的優(yōu)良品種，保持三疣梭子蟹養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)健康發(fā)展提供遺傳種質(zhì)依據(jù)。

微衛(wèi)星因為具有在基因組中廣泛分布、易于檢測等特性，因此微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)在種質(zhì)遺傳以及保護生物學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。微衛(wèi)星DNA(Microsatellite DNA)是指以少數(shù)幾個核苷酸(1～6個)為單位多次重復(fù)的簡單序列，因而也被稱為簡單序列重復(fù)(simple sequence repeats,SSR)[5]。因等位基因突變快、多態(tài)性高、雜合度高、信息含量豐富和呈孟德爾共顯性等顯著優(yōu)點[6]，微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于例如人類、靈長類動物、農(nóng)作物等連鎖群的構(gòu)建和物理圖譜的繪制[7-9]。

目前，相關(guān)的分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于三疣梭子蟹的種質(zhì)資源保護的研究當(dāng)中。微衛(wèi)星標(biāo)記也已經(jīng)被應(yīng)用到了三疣梭子蟹的資源保護領(lǐng)域，并在其種群遺傳結(jié)構(gòu)分析等方面進行了相關(guān)應(yīng)用[10-12]。但由于目前篩選得到的關(guān)于三疣梭子蟹的SSR標(biāo)記的數(shù)量比較少，微衛(wèi)星標(biāo)記的缺乏已經(jīng)對三疣梭子蟹的種質(zhì)資源保護、遺傳圖譜構(gòu)建及遺傳性狀等相關(guān)研究造成了障礙。為獲得大量的SSR分子標(biāo)記，突破三疣梭子蟹相關(guān)遺傳和資源保護領(lǐng)域的研究瓶頸，本文利用5’錨定引物法篩選開發(fā)了一批新的微衛(wèi)星標(biāo)記，這樣既豐富了三疣梭子蟹的分子標(biāo)記資源，也為進一步的三疣梭子蟹輔助育種提供必要的遺傳學(xué)理論支持。

1 材料和方法

1.1 基因組DNA提取

實驗所需三疣梭子蟹樣品采自舟山東門水產(chǎn)品市場。取兩只三疣梭子蟹腿部肌肉于1.5 mL離心管中，加入 300 μL 裂解液(10 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L EDTA，10 mmol/L NaCl，1%SDS，pH 8.0)，將管足組織于離心管中充分剪碎，加入25 mg/ml蛋白酶K 10 μL，55℃水浴直到組織完全溶解。稍微冷卻后，加入300 μL飽和酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，充分混勻，10 000 r/min離心10 min;取上清，重復(fù)抽提3次至上清液澄清；上清液中加入2倍體積的冰乙醇沉淀30 min。10 000 r/min離心10 min后用75%乙醇清洗2次，室溫晾干后溶于50 μl TE溶液，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 5’錨定引物擴增

實驗所用引物序列為P(CT)6=KKVRVRV(CT)6，K=G/T,V=G/C/A,R=G/A。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

將提取的2只三疣梭子蟹樣個體的DNA等體積混合作為模板，直接用錨定引物PCR擴增，擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳檢測，利用TIANquick Midi Purification Kit試劑盒將300～1 000 bp大小的擴增片段回收純化，回收步驟參照試劑盒說明書。建立25 μL的PCR反應(yīng)體系，其中包含1 μL混合DNA模板，1.5 μL 錨定引物，1.2 μL dNTP，1×buffer，1 U Taq酶。PCR 反應(yīng)程序設(shè)定為：95 ℃預(yù)變性 5 min,然后95 ℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，7個循環(huán)；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；最終延伸10 min。

1.3 克隆及測序

建立 10 μL 的連接體系，包括 5 μL Solution I，4.5 μL 純化后的 PCR 產(chǎn)物，0.5 μL 的 pMD19-T vector(Takara)，16℃連接過夜。然后用DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞進行轉(zhuǎn)化，根據(jù)藍(lán)白斑篩選原則挑取平板上的單個菌落擴大培養(yǎng)。

利用M13系列通用引物對菌液進行陽性檢測，10 μL的PCR體系包含1 μL菌液，M13上下游引物各10 pM。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果，隨機挑選300 bp以上的克隆子送到南京金斯瑞生物科技公司測序。

1.4 序列分析及統(tǒng)計

測序結(jié)果用Chromas軟件進行峰圖分析，DNAMAN去除重復(fù)序列，按照如下參數(shù)：一、二、三、四、五核苷酸，最低重復(fù)次數(shù)分別為12、6、3、3、3、3次，典型的雙核苷酸微衛(wèi)星核心序列的最小長度為12 bp，以此標(biāo)準(zhǔn)搜索微衛(wèi)星位點并進行統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1 擴增條件篩選

錨定引物PCT分別在49℃、52℃、55℃、58℃四個退火溫度下進行擴增，結(jié)果顯示PCT引物在三疣梭子蟹基因組中55℃退火溫度下擴增效果最佳，凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1所示。

2.2 序列分析及統(tǒng)計結(jié)果

對41個克隆子進行測序，其中35條序列含有微衛(wèi)星位點，陽性克隆比率達(dá)到85.4%。去除重復(fù)序列后進行微衛(wèi)星搜索并進行分類統(tǒng)計見表1，結(jié)果顯示共檢測到55個微衛(wèi)星位點，分布于20條序列中，其中19條序列檢測到2個或2個以上微衛(wèi)星位點。

在獲得的55個微衛(wèi)星位點中，核心序列為(CT/AG)的微衛(wèi)星位點有27個(50%)，除此之外還包含27個其他類型重復(fù)的微衛(wèi)星(50%)，27個中多為三堿基或者4堿基重復(fù)，重復(fù)次數(shù)在3以上。對這些微衛(wèi)星位點的重復(fù)類型進行統(tǒng)計，其統(tǒng)計結(jié)果如圖2所示。

圖1 PCT引物在三疣梭子蟹基因組中的擴增結(jié)果Fig.1 PCR profiles produced from genomic DNA.泳道 1為marker，泳道 2-5分別為49℃、52℃、55℃、58℃四個退火溫度下的擴增結(jié)果

表1 微衛(wèi)星位點的搜索及統(tǒng)計結(jié)果Tab.1 Searching and statistics of microsatellite site

按照WEBER[13]提出的分類標(biāo)準(zhǔn)，微衛(wèi)星可以分為三種類型即：P型、I型、C型。P型（完美型perfect)指沒有中斷的或附近無其它重復(fù)序列的重復(fù)序列，I型（非完美型imperfect)指2個或2個以上的同種重復(fù)序列，被3個堿基以下的非重復(fù)序列所間隔，C型（混合型compound)指一種重復(fù)序列與其它種類的重復(fù)序列被3個堿基以下的非重復(fù)序列所間隔。根據(jù)此分類標(biāo)準(zhǔn)，對該實驗中檢測到的微衛(wèi)星位點進行位點特征分析，結(jié)果顯示：有2個位點屬于非完美型(3.70%)，未曾出現(xiàn)復(fù)合型，結(jié)果顯示見表2。

3 討論

圖2 微衛(wèi)星標(biāo)記的重復(fù)類型Fig.2 Repeat type of microsatellite markers I為非完美型微衛(wèi)星位點

表2 微衛(wèi)星序列的特征統(tǒng)計Tab.2 Characteristics Statistics of microsatellite markers

三疣梭子蟹由于其豐富的營養(yǎng)價值以及其味鮮等特性，已經(jīng)逐漸成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)重要的養(yǎng)殖對象。目前，三疣梭子蟹大規(guī)模人工養(yǎng)殖已經(jīng)在中國沿海地區(qū)廣泛展開。由于三疣梭子蟹人工養(yǎng)殖親本主要來源于天然海捕親蟹,并未培育出適于人工養(yǎng)殖的新品種或新品系,因而近幾年在三疣梭子蟹人工養(yǎng)殖過程中頻頻出現(xiàn)諸如病害頻發(fā)、抗逆性差、性早熟等現(xiàn)象,嚴(yán)重制約了三疣梭子蟹人工養(yǎng)殖的健康發(fā)展[14-15]，這就促使廣大科研工作者要對三疣梭子蟹種質(zhì)資源現(xiàn)狀開展研究分析。在分子標(biāo)記研究方面，三疣梭子蟹的線粒體基因組已經(jīng)獲得[16]，另外，一些學(xué)者也開發(fā)了一系列的微衛(wèi)星分子標(biāo)記并應(yīng)用于親子鑒定及資源研究中[17-19]。

微衛(wèi)星DNA首先由SKINNER等[20]在寄居蟹中發(fā)現(xiàn)，因其位點數(shù)量多、多態(tài)信息含量高、高重復(fù)性、孟德爾共顯性方式遺傳及檢測快速等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)研究中。在微衛(wèi)星標(biāo)記的引物設(shè)計中微衛(wèi)星序列的選取是關(guān)鍵的一步。目前得到微衛(wèi)星序列的主要途徑主要有兩種即：一是通過構(gòu)建富含微衛(wèi)星的基因組文庫，進而雜交篩選出含有微衛(wèi)星序列的陽性克隆，通過測序得到含有微衛(wèi)星DNA的的片段序列；二是省略構(gòu)建文庫，直接從數(shù)據(jù)庫中利用微衛(wèi)星搜索軟件篩選含有微衛(wèi)星DNA的序列信息，或是利用近緣物種的已知位點，這種方法省時有效，但受限于數(shù)據(jù)庫的資源量。構(gòu)建文庫的方法中，普遍被使用的有FACSO方法和5’錨定法。5’錨定引物法是由FISHER等[21]發(fā)明，因高效率及快速等優(yōu)點，被廣泛用于篩選微衛(wèi)星標(biāo)記。該方法是在一段少量重復(fù)序列的5’端添加幾個簡并堿基構(gòu)成錨定引物，擴增兩個相鄰的特定微衛(wèi)星位點及其之間的序列。5’錨定引物法有幾大優(yōu)點：首先是避了免獲得的微衛(wèi)星重復(fù)區(qū)域的側(cè)翼序列過短而導(dǎo)致不能用來設(shè)計特異引物；其次是可用于構(gòu)建富含某特定位點的微衛(wèi)星文庫；然后是在擴增特定位點的同時，可能會獲得其他類型的位點，因此每測一條序列即可獲得至少2個微衛(wèi)星位點，具有較高的篩選效率。

BRENNER等[22]的研究表明，(CT)n類型的微衛(wèi)星序列在動物個體中含量豐富，僅次于(CA)n重復(fù)，結(jié)合劉媛等[23]分析三疣梭子蟹EST序列微衛(wèi)星分布的研究結(jié)果，本實驗采用PCT錨定引物，(CT)6的5’端加有簡并堿基KKVRVRV，其中VRVRV形成封閉，防止在擴增是引物在GA重復(fù)上發(fā)生滑動，確保擴增的多態(tài)的真實性。PCT錨定引物擴增的是相鄰的CT和AG重復(fù)類型的微衛(wèi)星及其之間的序列。測序后得到的35條序列中，核心序列為(CT/AG)重復(fù)的微衛(wèi)星有27個，占篩選總數(shù)的50%。該試驗采取錨定的方法，得到的（CT/AG）的重復(fù)類型的微衛(wèi)星位點在所有的位點中數(shù)量上占絕對的優(yōu)勢。因此從實驗結(jié)果可以看出，該錨定方法篩選三疣梭子蟹(CT/AG)類型的微衛(wèi)星位點較成功。而且從微衛(wèi)星類型上可以看出，三疣梭子蟹的微衛(wèi)星類型很豐富，這也為接下來三疣梭子蟹的研究提供一定的理論依據(jù)。

本研究篩選的這些微衛(wèi)星標(biāo)記為三疣梭子蟹構(gòu)建連鎖群及遺傳圖譜，開展種群遺傳結(jié)構(gòu)分析，并對品種選育和種系評估提供了可靠的分子標(biāo)記，也為進一步研究三疣梭子蟹的群體遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)打下堅實的理論基礎(chǔ)。

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