張振強，王叢笑，賈亞泉，宋軍營，劉學芳，呂歡歡，張運克

（河南中醫(yī)學院 科研實驗中心，河南 鄭州 450008）

高脂血癥能夠通過損傷內皮細胞，分泌炎癥因子和生長因子，誘導單核細胞集聚、粘附于內皮細胞，并遷入內皮下間隙，引起T淋巴細胞的浸潤，參與炎癥與免疫過程。單核細胞集聚經多種受體介導，不斷地攝取已經進入內膜發(fā)生氧化的脂質，形成單核細胞源性泡沫細胞；內皮細胞更新、增生并分泌生長因子，可激活動脈中膜平滑肌細胞，并經內彈力膜的窗孔遷入內膜，并發(fā)生增生、轉化、分泌細胞因子及合成細胞外基質，經其表面的受體介導吞噬脂質，形成平滑肌源性泡沫細胞。在動脈粥樣硬化病變過程中，損傷的內皮細胞通過分泌血管調節(jié)因子實現(xiàn)對功能血管調節(jié)，血管調節(jié)因子的變化對血管、組織有何作用，我們實驗將其進行分析。

1 資料和方法

1.1 實驗動物與分組

健康雄性SPF級12 周 齡Wistar 大鼠，體重280～300g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司（SCXK（京）2007－0001），質量合格證號：0243109。實驗動物隨機分為正常對照組、高脂血癥組，每組10只。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 主要儀器 全自動生化分析儀（奧林巴斯，型號AU2700）；酶標儀（Thermo，型號MK3）；洗板機（Thermo，型號WELLWASH 4MK2）；自動平衡離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司，型號TDZ5－WS）；DT300A型電子天平（上海醫(yī)用激光儀器廠常熟分廠）。

1.2.2 主要試劑 體積分數(shù)為10%水合氯醛（武漢市和昌化工有限公司）；PBS 緩沖液（上海富眾生物科技發(fā)展有限公司）；免疫組化試劑von Willebrand、NO、ET－1、6－keto－FGF1a、TX－B2、一抗、二抗及鏈霉菌抗生物素－過氧化物酶溶液（購自武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 高脂血癥動物模型制備方法 高脂血癥組大鼠每天以高脂飼料（組成：3.5%膽固醇、10%豬油、0.2%丙硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉、5%白糖、80.8%基礎飼料）喂養(yǎng)，正常組以清潔級正常飼料喂養(yǎng)，4周后正常組與高脂血癥組分別斷尾取血約0.5～1mL，檢測血脂四項，高脂血癥組血脂指標與正常組相比較具有明顯區(qū)別，則說明模型制備成功，否則繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.3.2 血清采集 模型制備成功后，每組各取動物5只，以體積分數(shù)為10%水合氯醛（0.3mL／100g）腹腔注射麻醉，背位固定于鼠板上，腹主動取血5mL，靜置30 min，以3000r／min 離心15 min，取上清液，－20℃冰箱冷凍，備用。

1.3.3 檢測血清中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL－C）和低密度脂蛋白（LDL－C）的含量 取血清0.5～1mL，置于5mL 試管中，按總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDLC）和低密度脂蛋白（LDL－C）試劑盒說明書，采用全自動生化分析儀進行檢測。

1.3.4 酶聯(lián)免疫方法（ELISA） 檢測血清中von Willebrand、NO、ET－1、6－keto－FGF1a、TX－B2的 含量，依照試劑盒說明書步驟進行操作。

2 結果

2.1 血脂（總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL－C）、低密度脂蛋白（LDL－C））的檢測結果

利用全自動生化分析儀進行血脂檢測，測定結果從表1可以看出，與正常組比較，高脂血癥組大鼠血清中總膽固醇、高密度脂蛋白、甘油三酯和低密度脂蛋白顯著升高，有明顯差異（P＜0.05）。

表1 血脂四項檢測結果（）

2.2 內皮細胞功能障礙標志物

血管性血友病因子（von Willebrand）的表達情況測定結果從表2可以看出，與正常組相比，高脂血癥大鼠的血清中von Willebrand的表達顯著增加（0.01＜＊＊P＜0.05）。

2.3 血管調節(jié)因子

一氧化氮（NO）、內皮素（ET－1）、6－酮前列環(huán)素1a（6－keto－FGF1a）和血栓素B2（TX－B2）的表達情況從表3結果中可以看出，與正常組相比，高脂血癥組大鼠的血清中一氧化氮（NO）和6－酮前列環(huán)素1a（6－keto－FGF1a）的表達降低，差異顯著（0.01＜P＜0.05），而血栓素B2（TX－B2）的表達明顯增加（P＜0.05），內皮素的表達沒有顯著變化。

表2 內皮細胞功能障礙標志物von Willebrand因子的表達情況（）

表3 血管調節(jié)因子（NO、ET－1、6－keto－FGF1a、TX－B2）的表達情況（）

3 討論

血管內皮細胞的完整性是維持正常血流狀態(tài)、血管通透性及防御炎癥反應的基礎［1］。高脂血癥可引起內皮細胞損傷，尤其OX－LDL 是造成內皮細胞損傷、誘導內皮細胞促炎癥分子表達的主要因素［2］。血管性假血友病因子（vWF）反應內皮功能的敏感指標。我們研究顯示，2 組間差異顯著（0.01＜P＜0.05），表明高脂血癥大鼠模型的血管內皮細胞明顯受損。

血管內皮細胞通過合成和釋放NO、PGI2、ET－1等生物活性物質，調節(jié)生理條件下小血管的舒張和收縮、抑制血小板聚集、炎癥細胞浸潤及炎癥因子的過度表達［3］。血管內皮細胞是動脈硬化的始動環(huán)節(jié)，血脂成份通過血管內皮細胞表面受體進入內皮細胞并遷移至內皮下積聚，刺激平滑肌的增生，引起內皮細胞功能障礙及損傷，使NO、PGI2、ET－1等表達失衡，啟動病理過程的發(fā)生［4］。

NO／ET－1主要由內皮細胞合成和分泌的一對功能拮抗的活性物質。ET－1有收縮血管、血小板集聚及平滑肌增殖等功能，能夠協(xié)同生長因子。促進生長因子促平滑肌的增殖，是動脈硬化的重要因素之一［5］。NO 具有舒張血管、抗氧化和傳遞細胞間生物信息的作用，同時，還可抑制SMC 增殖、血小板集聚、單核細胞黏附、膠原纖維生成等，對血管壁起到保護作用［6］。

PGI2／TX－A2具有調節(jié)血管功能。PGI2由內皮細胞合成和分泌，具有舒張血管、抑制血小板集聚和平滑肌增殖等功能［7－8］。TX－A2主要具有血小板顆粒合成和釋放、收縮血管和促使血小板聚集的功能［9］。由于PGI2／TX－A2性質不穩(wěn)定，半衰期較短，常測定其代謝物6－keto－FGF1a、TX－B2含量以代表PGI2和TX－A2的表達情況。

研究結果顯示，高脂血癥模型組NO、6－keto－FGF1a與對照組相比，含量降低，有顯著性差異（0.01＜P＜0.05），TX－B2則升高，有明顯差異（P＜0.05）。這表明高脂血癥模型可能通過血管內皮細胞功能失衡，減少NO、PGI2的分泌，使ET－1相對升高，激活血小板顆粒，釋放TX－A2，誘發(fā)形成動脈硬化。雖然血管收縮因子ET－1、TX－A2相對或絕對升高，但平滑肌處于增生狀態(tài)，不一定能夠表現(xiàn)出血管收縮的功能。

高脂血癥誘發(fā)血管動脈硬化的病理過程復雜，其中內皮細胞損傷是關鍵因素［10］。我們研究表明，血管調節(jié)因子的失衡可能在動脈硬化發(fā)病過程中起一定的作用。保護內皮細胞或平衡血管調節(jié)因子可能是防治高脂血癥誘發(fā)早期動脈硬化病變過程中的一個關鍵節(jié)點。

［1］陳雁，楊曉晶，白海濤.血管內皮損傷與修復的研究進展［J］.醫(yī)學綜述，2010，16（17）：2573－2576.

［2］Wong W T，Ng C H，Tsang S Y，et al.Relative contribution of in dividual oxidized components in ox－LDL to inhibition on endothelium－dependent relaxation in rat aorta［J］.Nutr Metab Car diovase Dis，2009，21（3）：158－164.

［3］Russell N J.Psychrophilic bacteria－molecular a daptations of membrane lipi ds［J］.Comp Biochem Physiol A Physiol，1997，118（3）：489－493.

［4］Takahashi K，Ohyanagi M，Ikeoka K，et al.Acetylcholine－In duced response of coronary resistance arterioles in cholesterol－fed rabbits［J］.Jpn J Pharmacol，1999，81（2）：156－162.

［5］Leppaluto J，Ruskoaho H.Endothelin Pepti des：biological aetivities Celluar signaling and inieal significance［J］.Ann Med，1992，24（6）：53.

［6］Strewart D J，Kubac G，Costello K B.Increased Plasmaen dothlin－lintheearly hours of acute myoear dial infaretion［J］.Jace，1991，18（1）：38.

［7］王殿彬，陳汝賢，李建勇，等.糖尿病患者微血管病變與血小板功能［J］.江蘇醫(yī)藥.1994，20（3）：121－123.

［8］Stokes K Y，Calahan L，Russell J M，et al.Role of platelets in hypercholesterolemia－in duced leukocyte recruitment and arteriolar dysfunction［J］.Microcirculation，2006，13（5）：377－388.

［9］寧英遠，任建功，朱秀珍，等.糖尿病微血管病變患者血漿TE，TX－B2，6－keto－PGF1a的變化［J］.臨床薈萃.1999，14（8）：345－434.

［10］張振強，宋軍營，賈亞泉.缺血性腦血管疾病研究進展［J］.河南大學報：醫(yī)學版，2012，31（4），312－317.