李 勉，丁艷霞，詹傳紅

（河南大學(xué) 藥學(xué)院，河南 開封 475004）

大黃（Rhubarb）為蓼科植物掌葉大黃、唐古特大黃和藥用大黃的干燥根及根莖，是臨床常用瀉下中藥。中國藥典（2010年版）對大黃的質(zhì)量控制以5種游離蒽醌衍生物總量為指標(biāo)，該項(xiàng)指標(biāo)反映的是大黃的抗菌成分，測定指標(biāo)與瀉下藥效成分無明確對應(yīng)。研究［1］表明，結(jié)合性蒽醌衍系大黃的主要瀉下成分中以雙蒽酮苷——番瀉苷A、B作用最強(qiáng)。測定番瀉苷A（sennoside A）、番瀉苷B（sennoside B）的方法有分光光度法、薄層掃描法［2］、高效毛細(xì)管電泳法［3］、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法［4］，這些方法操作流程繁瑣，條件要求較苛刻。我們的實(shí)驗(yàn)在參照文獻(xiàn)［5－7］的基礎(chǔ)上，建立了測定大黃藥材中番瀉苷A和B 含量的HPLC方法，為研究不同產(chǎn)地大黃瀉下作用奠定基礎(chǔ)，為全面評價(jià)大黃品質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

LC－10A型高效液相色譜儀（日本島津）；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器（北京卓信偉業(yè)科技有限公司）；FA1004N 電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限責(zé)任公司）；SHB－Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限責(zé)任公司）；甲醇為色譜純（天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司）；所用水為高純水；其余試劑均為分析純；番瀉苷A和番瀉苷B對照品（中國藥品生物制品檢定所提供）。

市場上隨機(jī)購買10種大黃作為實(shí)驗(yàn)材料，標(biāo)記樣品號為1～10，分別為1號開封北羊市藥店大黃，2號鞏義市（禹州進(jìn)貨2）大黃，3號開封南羊市藥店（內(nèi)蒙古）大黃，4號開封市天濟(jì)大藥房（內(nèi)蒙古馬蹄）大黃，5號鞏義（禹州進(jìn)貨1）大黃，6號安陽市藥檢所大黃，7號盧氏縣藥檢所大黃，8 號生藥實(shí)驗(yàn)室大黃，9號安陽市藥檢所山大黃，10號華北大黃。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液制備

精密稱取番瀉苷A 對照品0.88 mg，番瀉苷B對照品0.6mg，置10mL容量瓶中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%碳酸氫鈉溶液使溶解，定容至刻度，配制成含番瀉苷A 88mg／L、番瀉苷B 60mg／L的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取大黃樣品粉末，精密稱定1.0g，各自加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1% 碳酸氫鈉溶液25 mL，超聲提取30min，用普通漏斗過濾得濾液并補(bǔ)足到25 mL，濾液用0.45μm 微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.3 色譜條件

色譜 柱：E1718897 Hypersil C18（4.6 mm×250mm，25μm）；流動(dòng)相：四氫呋喃－水－醋酸（15∶85∶1.5）；流速：0.8 mL／min；檢測波長：350nm；柱溫：20℃；進(jìn)樣量：20μL。在此色譜條件下番瀉苷A和B 分離度良好，不受藥材中雜質(zhì)的干擾，結(jié)果見圖1、圖2、圖3。

圖1 對照品HPLC色譜圖

圖2 5號大黃HPLC色譜圖

圖3 6號大黃HPLC色譜圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系考察

精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液2、5、8、10、15、20μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，并以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。番瀉苷A：Y＝62517 X －39583，r＝0.9995，說明番瀉苷A 在0.176～1.76g／L 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系；番瀉苷B：Y＝52532 X－23427，r＝0.9995，說明番瀉苷B在0.12～1.2g／L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取番瀉苷A和B混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液20μL，按照“2.3”項(xiàng)下進(jìn)行測定，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測定峰面積，測得番瀉苷A、番瀉苷B 峰面積的RSD 分別為1.681%和2.173%。結(jié)果表明，儀器的精密度良好。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密吸取上述制備好的5 號供試品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下進(jìn)行測定，測得結(jié)果為供試品中番瀉苷A、番瀉苷B 峰面積的RSD 分別為2.21%和1.96%（n＝6）。表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取上述制備好的5號供試品溶液20μL，分別于0、2、4、6、8、12、24h進(jìn)樣，測得樣品中番瀉苷A、番瀉苷B峰面積值的RSD 分別為2.52%和1.75%。表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品約1g，6 份，分別加入番瀉苷A和番瀉苷B適量，按照“2.2”項(xiàng)下供試品制備辦法制備供試品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下進(jìn)行測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1、表2。

2.9 樣品的含量測定

精密吸取供試品溶液各20μL，分別注入高效液相色譜儀，根據(jù)供試品的峰面積求得番瀉苷A、番瀉苷B的含量。結(jié)果見表3。

表1 番瀉苷A 回收率試驗(yàn)

表2 番瀉苷B回收率試驗(yàn)

表3 不同產(chǎn)地大黃中番瀉苷A、番瀉苷B的含量測定結(jié)果（%）

續(xù)表3

3 結(jié)果與討論

中國藥典2010版對大黃的質(zhì)量控制為以5種蒽醌苷元總量為指標(biāo)，測定指標(biāo)與瀉下藥效成分無明確對應(yīng)。通過建立番瀉苷高效液相色譜含量測定方法，為大黃的定量分析、品質(zhì)評價(jià)提供了準(zhǔn)確有效的分析方法，為國家有關(guān)部門制定大黃藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

我們首先對不同來源的10種大黃藥材進(jìn)行簡單的顯微鑒定，發(fā)現(xiàn)安陽市藥檢所大黃、安陽市藥檢所的山大黃、華北大黃的顯微特征不太明顯。進(jìn)一步通過HPLC法對上述大黃進(jìn)行番瀉苷含量測定，番瀉苷總含量分別為0.2073%、0.2538%、0.0696%，鞏義（禹州進(jìn)貨1）購買的大黃為0.8431%。

HPLC法測定發(fā)現(xiàn)不同來源的各種大黃中番瀉苷的含量有較大差異，如鞏義（禹州進(jìn)貨1）大黃中番瀉苷含量最高，盧氏縣藥檢所提供的大黃及生藥實(shí)驗(yàn)室大黃中番瀉苷含量稍低，而開封北羊市藥店大黃、鞏義（禹州進(jìn)貨2）大黃、開封南羊市藥店（內(nèi)蒙古）大黃番瀉苷含量很低。

［1］中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：17－18.

［2］陸春桃，王富.大黃功效索解［J］.四川中醫(yī)，2006，24（8）：37－38.

［3］劉仁俊，崔曉立.高效液相色譜法測定大黃中番瀉苷A 含量［J］.中國衛(wèi)生工程學(xué)，2010，9（4）：306.

［4］李敏，李麗霞，劉渝，等.大黃研究進(jìn)展［J］.世界科學(xué)技術(shù)－中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2006，8（4）：38－38.

［5］孫佩，李敏，楊小多，等.HPLC 法測定大黃藥材和飲片中番瀉苷A和番瀉苷B的含量［J］.成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，31（3）：52－56.

［6］陳勇，李文霞.HPLC法測定通便靈膠囊中番瀉苷A的含量［J］.西北藥學(xué)雜志，2006，21（3）：102－104.

［7］呂曙華，呂歸寶.HPLC法測定番瀉葉中番瀉苷A 及番瀉苷B的含量［J］.中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2002，3（5）：48－50.